黑蕓豆凝集素的純化和生物信息學(xué)及結(jié)構(gòu)與功能特性研究.pdf

1、凝集素是一類具有重要生物活性的糖蛋白，可用于血型鑒定、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、惡性腫瘤細(xì)胞抑制、免疫應(yīng)答和藥物靶向定位的研究中，同時(shí)，凝集素也是食品中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。凝聚素主要存在于豆類中，黑蕓豆是種植量較大的蕓豆品種之一，研究發(fā)現(xiàn)黑蕓豆中凝聚素的含量較高，但對(duì)黑蕓豆凝集素的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)性質(zhì)的認(rèn)識(shí)非常有限。本文對(duì)黑蕓豆凝集素的分離純化、凝集素的結(jié)構(gòu)、凝集素的理化性質(zhì)及生物學(xué)特性與凝集素結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)性研究，可為豆類凝集素功能性開(kāi)發(fā)提供理論

2、基礎(chǔ)。
　　本研究采用反膠束萃取方法對(duì)蕓豆水溶性蛋白粗提取物中的凝集素進(jìn)行了分離純化，并研究了反膠束萃取方法對(duì)凝集素活性和結(jié)構(gòu)的影響。確定反膠束萃取凝集素的工藝參數(shù)為：前萃取水相NaCl濃度為77.6 mmol/L，pH值為5.7，AOT（二(2-乙基已基)丁二酸酯磺酸鈉）濃度為127.4 mmol/L；后萃取水相KCl濃度為593.0 mmol/L，pH值為8.0；在最佳工藝條件下，凝集素的得率為63.2±2.4 mg蛋白/g豆

3、，純化倍數(shù)為8.8±0.2倍。反膠束萃取法對(duì)凝集素的活性沒(méi)有影響；經(jīng)傅立葉變換紅外光譜和圓二色光譜分析可知，反膠束萃取對(duì)凝集素蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著的影響。反膠束法萃取的凝集素樣品經(jīng)色譜純化后純度可達(dá)到94％以上，比傳統(tǒng)的離子交換和分子篩純化方法的蛋白得率提高了70%。
　　基于LC-MS/MS方法，確定反膠束萃取分離純化的蛋白為凝集素，與PHA-E蛋白具有高度同源性。以黑蕓豆基因組DNA為模板，依據(jù)PHA-E蛋白cDNA序列合成的

4、特異引物進(jìn)行同源克隆，獲得黑蕓豆凝集素蛋白的編碼基因序列。根據(jù)同源分析和進(jìn)化分析可知，黑蕓豆凝集素高度保守，可能與PHA-E蛋白共同分化自Arc7變種。根據(jù)對(duì)黑蕓豆凝集素的生物信息學(xué)分析，黑蕓豆凝集素為親水蛋白，具有較高的穩(wěn)定性，含有疏水內(nèi)核區(qū)；在生理 pH值下黑蕓豆凝集素可能以四聚體形式存在，含有高度保守的Lectin_legB功能結(jié)構(gòu)域；蛋白分子中含有Ca2+和Mn2+結(jié)合位點(diǎn)及可能與 N端糖基特異性結(jié)合的位點(diǎn)；研究表明黑蕓豆凝集素

5、含有B淋巴細(xì)胞抗原表位和T淋巴細(xì)胞抗原表位，具有潛在的抗癌細(xì)胞活性。
　　黑蕓豆凝集素單體分子量為31 kDa，四聚體分子量約為116.97 kDa；黑蕓豆凝集素單體的等電點(diǎn)在5.27左右，二聚體等電點(diǎn)在6.03左右，四聚體等電點(diǎn)在6.91左右。利用熒光光譜法證明黑蕓豆凝集素蛋白可與N-乙酰-D-葡萄糖胺發(fā)生特異性結(jié)合，親和常數(shù)約為0.45 mmol/L，為中等強(qiáng)度的親和作用?；谀鼗钚曰謴?fù)的方法，證明黑豆凝集素為金屬離子依賴

6、性蛋白，Mn2+和Ca2+是黑蕓豆凝集素蛋白的必需金屬離子。對(duì)黑蕓豆凝集素?zé)崾Щ钆c蛋白構(gòu)象之間的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)加熱導(dǎo)致凝集素蛋白折疊結(jié)構(gòu)的打開(kāi)，使凝集素發(fā)生變性，凝集素的熱變性程度與加熱溫度和時(shí)間呈函數(shù)關(guān)系，其熱穩(wěn)定性符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。采用紫外、熒光光譜和DSC法對(duì)黑蕓豆凝集素的酸堿穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果表明在pH2.0～10.0范圍內(nèi)凝集素具有相對(duì)穩(wěn)定的蛋白構(gòu)象。
　　采用指數(shù)數(shù)學(xué)模型分析電泳條帶光密度變化，建立了較為準(zhǔn)確的

7、體外模擬胃腸道消化評(píng)價(jià)體系，研究結(jié)果表明：黑蕓豆凝集素在模擬胃液和胰蛋白酶消化環(huán)境下穩(wěn)定性較好，半衰期分別為23 min和大于90 min；加熱和去離子化處理改變了凝集素的蛋白構(gòu)象，使得凝集素在模擬胃腸道環(huán)境下的消化性提高。MTT實(shí)驗(yàn)研究證明，在2 h內(nèi)黑蕓豆凝集素對(duì)腸道模擬上皮細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。致敏實(shí)驗(yàn)證明低劑量黑蕓豆凝集素（6 mg/120 g大鼠）未誘發(fā)動(dòng)物模型的致敏癥狀，黑蕓豆凝集素可同時(shí)促進(jìn)IL-4和INF-γ細(xì)胞因子的分泌

8、，兩者的拮抗作用可能導(dǎo)致IgE抗體的表達(dá)未達(dá)到陽(yáng)性癥狀水平，研究結(jié)果證明低劑量黑蕓豆凝集素蛋白不具有致敏性。
　　初步研究了黑蕓豆凝集素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制作用，黑蕓豆凝集素的IC50值為9.85μg/mL，凝集素對(duì)Hela細(xì)胞的抑制能力與作用劑量和時(shí)間呈正相關(guān)，高劑量的凝集素可使Hela細(xì)胞凋亡或壞死；當(dāng)凝集素濃度低于IC50值時(shí)，Hela細(xì)胞以凋亡為主，當(dāng)凝集素濃度高于IC50值時(shí)，Hela細(xì)胞以晚期凋亡和死亡為主；此