電化學(xué)多肽生物傳感器信號(hào)放大策略的研究.pdf

1、蛋白酶是一種水解蛋白質(zhì)或多肽的水解酶，它與人體代謝過程如細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、組織重塑和免疫防御等有關(guān)，已作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床檢測(cè)。建立簡(jiǎn)單、靈敏、特異和快速的生物標(biāo)志物檢測(cè)方法，對(duì)疾病的預(yù)防、診斷和治療具有十分重要的意義。電化學(xué)生物傳感器是將特異性分子識(shí)別物質(zhì)例如抗體、酶、適體、多肽等固定在換能器上，以電化學(xué)信號(hào)為檢測(cè)信號(hào)的分析器件，在分析化學(xué)的研究領(lǐng)域中起著越來越重要的地位。將多肽作為分子識(shí)別物質(zhì)，與抗體和酶相比，它穩(wěn)定、可靠、成本低

2、，并且具有高的親和性，較強(qiáng)的生物活性等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白酶生物標(biāo)志物的檢測(cè)中得到人們的廣泛關(guān)注。本論文以多肽作為分子識(shí)別物質(zhì)，致力于設(shè)計(jì)不同的信號(hào)放大策略，構(gòu)建了一系列操作簡(jiǎn)便、成本低廉的電化學(xué)多肽傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)前列腺抗原（一種絲氨酸蛋白酶）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-7的高靈敏檢測(cè)，具體工作如下：
　　1.基于帶正電荷的金納米粒子為信號(hào)增強(qiáng)劑檢測(cè)前列腺抗原的電化學(xué)多肽傳感器研究
　　大部分的電化學(xué)多肽傳感器是基于目標(biāo)物

3、對(duì)標(biāo)記信號(hào)標(biāo)簽的多肽進(jìn)行剪切而構(gòu)建的“信號(hào)衰減型”（signal-off）傳感器，其靈敏度受到限制，且易產(chǎn)生假陽性信號(hào)。當(dāng)前，金屬納米粒子由于可以克服一些酶生物材料固有的不穩(wěn)定性問題，已被廣泛用于信號(hào)放大。本工作中，基于正電荷的金納米粒子作為信號(hào)增強(qiáng)劑構(gòu)建了一種“信號(hào)增強(qiáng)型”（signal-on）的高靈敏的電化學(xué)多肽傳感器。正電荷的金納米粒子修飾在分子識(shí)別元件多肽上，它吸附測(cè)試底液中帶負(fù)電荷的氧化還原探針鐵氰化鉀（[Fe(CN)6]3

4、/4 ），加速了電子間的傳遞，獲得一個(gè)較低電化學(xué)阻抗值。在目標(biāo)物前列腺抗原（PSA）存在的條件下，PSA特異性地剪切多肽，從而使得正電荷的金納米粒子離開電極表面，在[Fe(CN)6]3 /4 底液中進(jìn)行電化學(xué)阻抗分析時(shí)，得到了一個(gè)較大的電化學(xué)阻抗值。通過監(jiān)測(cè)電化學(xué)阻抗值的變化，此傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物PSA的高靈敏檢測(cè)。此外，傳感體系是基于目標(biāo)物對(duì)多肽的特異性剪切所設(shè)計(jì)，具有較高的選擇性和靈敏度，為其他蛋白質(zhì)的分析提供了一個(gè)通用性的檢測(cè)方

5、法。
　　2.基于核酸外切酶輔助的循環(huán)放大策略檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-2的電化學(xué)多肽傳感器研究
　　將目標(biāo)物對(duì)肽鏈的剪切直接轉(zhuǎn)化為輸出DNA（output DNA），它可以進(jìn)一步地結(jié)合各種DNA放大技術(shù)實(shí)現(xiàn)高效信號(hào)放大，提高傳感器的靈敏度。本工作中將多肽剪切事件轉(zhuǎn)換為DNA檢測(cè)，并結(jié)合核酸外切酶III（EXO III）輔助目標(biāo)物循環(huán)信號(hào)放大策略構(gòu)建了一種超靈敏檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的電化學(xué)傳感器。所構(gòu)建的傳感體系可

6、總結(jié)以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：首先，“信號(hào)增強(qiáng)型”（signal-on）傳感器的設(shè)計(jì)，在一定程度上減小了由電極表面剝落或者污染導(dǎo)致的假陽性信號(hào)的產(chǎn)生；其次，把蛋白質(zhì)分析與DNA放大技術(shù)結(jié)合，有效地提高了傳感器的靈敏度；另外，基于金納米粒子（depAu）良好的導(dǎo)電性和葫蘆脲[7]與電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)（MB）之間強(qiáng)的主客體識(shí)別作用，采用CB[7]/depAu修飾的電極作為傳感界面有效地促進(jìn)了電活性物質(zhì)的采集；最后，此方法還可以拓展到其他具有酶剪切活性的

7、蛋白質(zhì)的檢測(cè)。
　　3.基于多肽剪切誘導(dǎo)的級(jí)聯(lián)信號(hào)放大策略檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-7的電化學(xué)多肽傳感器研究
　　多肽剪切事件可以直接轉(zhuǎn)化為輸出DNA（output DNA），然而，output DNA通常帶有氨基酸殘基，其位阻效應(yīng)會(huì)影響DNA的放大效率。為了解決這個(gè)問題，在本工作中，以指數(shù)放大反應(yīng)（EXPAR）作為模型，通過設(shè)計(jì)一個(gè)兩段式的DNA模板，構(gòu)建了一個(gè)高效的 DNA放大體系用于高靈敏檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP-7）

8、。基于這個(gè)兩段式的DNA模板，output DNA作為觸發(fā)劑1（trigger1）最先引發(fā)了一個(gè)低效率的EXPAR，反應(yīng)過程中不僅獲得部分產(chǎn)物DNA(S1)，還產(chǎn)生了與output DNA具有相同核苷酸序列的觸發(fā)劑2（trigger2）。由于trigger2不包含任何氨基酸殘基，它繼續(xù)誘導(dǎo)了一個(gè)額外的，高效的EXPAR放大，迅速地獲得大量的產(chǎn)物S1。產(chǎn)物S1作為催化劑進(jìn)一步誘導(dǎo)了催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)（CHA），獲得了級(jí)聯(lián)放大的電化學(xué)信號(hào)，