h_d交換質(zhì)譜分析法在結(jié)構(gòu)生物學研究中的應用

1、最初在 1954 年 Havidt[10] 等人發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)主鏈氨基上的氫原子能夠和溶液中的 D 交換，。Mandell[15]等人將 MALDI-TOF MS 和 H/D 交換聯(lián)合起來并將其作為研究蛋白質(zhì)之間H/D 交換質(zhì)譜分析法在結(jié)構(gòu)生物學研究中的應用#袁航，劉艷，陳培燕，林東海，趙玉芬**5101520（廈門大學化學化工學院，化學生物學系，化學生物學福建省重點實驗室，福建 廈門 361005）摘要：氫氘交換和質(zhì)譜相結(jié)合的分析方法廣泛

2、應用于蛋白質(zhì)的構(gòu)象及其動力學研究，其具有樣品用量少、快速、靈敏、簡便的優(yōu)點。本論文著重從氫氘交換的原理及相關(guān)機制；影響氫氘交換的各個因素；氫氘交換質(zhì)譜法中常用質(zhì)譜檢測儀器，以及質(zhì)譜檢測分析法等四個方面進行概述。關(guān)鍵詞：生物有機質(zhì)譜；氫氘交換；結(jié)構(gòu)生物學；綜述H/D exchange and mass spectrometry in Structural BiologyYuan Hang, Liu Yan, Chen Peiyan, Li

3、n Donghai, Zhao Yufen(Key Laboratory for Chemical Biology of Fujian Province, Department of Chemical Biology,Department of Chemistry, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University,FuJian XiaMen 361005)

4、Abstract: The combination of H/D exchange (HDX) and mass spectrometry technology is widely applied to the kinetic and conformational studies of proteins. The HDX-MS method has some advantages, such as fewer samples, fast

5、 detection and more sensitive than the traditional methods. In this review, we discussed four main contents in details, containing the principle and the mechanism of the exchange, the effects on the HDX, the application

6、of the equipments, and the specific HDX-MS methods. Keywords: bioorganic mass spectrometry; H/D exchange; structural biology; review250 引言目前，結(jié)構(gòu)生物學的研究方法主要包括 X-Ray[1]，NMR[2]和 MS[3]等技術(shù)。X-Ray 能夠獲得詳細的結(jié)構(gòu)信息，然而衍射效果好的蛋白質(zhì)晶體不容易得到，耗

7、時長，往往事倍功半，因此這種方法具有很大的局限性[4-7]。NMR 和 MS 是研究結(jié)構(gòu)生物學最常用的兩種工具，但303540是 NMR 對濃度的要求要高于質(zhì)譜 2 個數(shù)量級，同時核磁的檢測受到蛋白質(zhì)大小的限制，在≦30KDa 的條件下才能夠準確測定。此外，NMR 的靈敏度、蛋白質(zhì)的溶解度、分析時間的長短、獨立氨基質(zhì)子的分配等也是 NMR 技術(shù)的障礙[8]。MS 可以在 fmol 水平上準確分析分子量高達幾萬到幾十萬的生物大分子，具有樣

8、品消耗量少、分辨率高、準確性強、操作簡便的優(yōu)勢，并且能夠和其他的技術(shù)如液相色譜、氣相色譜、毛細管電泳技術(shù)聯(lián)用進行復雜樣品的分離分析[9]?！硰亩ㄟ^對蛋白質(zhì)主鏈的氫氘交換來調(diào)控蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度。1993 年，Zhang[11]等人將氫氘交換和 MS 聯(lián)用能夠在不改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的情況來探測蛋白質(zhì)的溶解度。NMR 和 H/D交換聯(lián)用可以測得蛋白質(zhì)特定位點的氫氘交換率，但是有些氨基上的氫原子交換速率太快，對于絕大部分的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間

9、的相互作用的研究，采用 NMR 技術(shù)還是無法做到的[12-14]基金項目：教育部新教師基金（200803841009） 作者簡介：袁航，（1987-），女，研究生，主要研究方向：生物有機質(zhì)譜。 通信聯(lián)系人：劉艷，(1976-)，女，副教授，主要研究方向:生物有機質(zhì)譜. E-mail: stacyliu@xmu.edu.cn-1-圖.2 HDX 交換機制示意圖。A 為 EX1 機制，B 為 EX2 機制。Fig. 2 The H/ D e

10、xchange mechanism. A: EX1; B: EX275 EX1 機制（圖.2 A）中，氫氘交換速率 K2 遠遠大于重新折疊的速率；而 EX2 機制（圖.2B）中，重新折疊和內(nèi)在的氫氘交換反應發(fā)生競爭，只有在發(fā)生了一部分重新折疊反應后，氫氘交換才能進行完全。EX 機制用公式表示如下式 1 所示[27]：X HclosedKopX HopenKchExchangeKcl808590其中，Kop 和 Kcl 分別是特定交換位點

11、的開關(guān)速率常數(shù)，Kch 為化學交換速率常數(shù)，可以表征完全未被保護的氫的交換動力學，對于氨基上的氫，某位點上 Kch 值取決于其相鄰的氨基酸側(cè)鏈和 pD 值 (pD=pH+0.4)[28]。在 pH≥4 時，化學交換速率受堿催化的影響，因此 Kex隨著 pH 的增加而增大，因此可以依據(jù) Kex 隨 pH 的變化來判斷 EX1 和 EX2[23]。從二肽模型化合物中獲得的參考數(shù)據(jù)對于任意溶劑條件下的 Kch 值的評估很有參考價值[29-31

12、]。在 EX2 機制中，Kcl>>Kch，整體的交換速率常數(shù)為 Kex 。Kex = Kop·Kch，則 Kop=Kop/Kcl是特定位點打開反應的速率常數(shù)，在 EX2 條件下，在交換反應未發(fā)生之前許多的位點處于打開的構(gòu)象狀態(tài)。相反的，在 EX1 條件下，Kch>>Kcl，在蛋白質(zhì)的開放區(qū)域?qū)l(fā)生完全的氘標記，此時 Kex=Kop〔[32]在自然狀態(tài)下，氨基 HDX 會遵循 EX2 機制，但是在蛋白質(zhì)