水稻亞細胞定位標記系穩(wěn)定遺傳株系培育及其應用初探.pdf

1、亞細胞定位，是指某種蛋白質(zhì)或者表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的具體存在部位。蛋白質(zhì)的功能與其所在的亞細胞位置密切相關(guān)，而亞細胞定位研究可以為確定某些未知蛋白質(zhì)的功能提供重要的參考信息。在前期研究中，本課題組已經(jīng)構(gòu)建了一套保守性定位于主要細胞器的、且攜帶有特異性熒光蛋白GFP/RFP融合結(jié)構(gòu)的植物表達載體，并初步獲得了轉(zhuǎn)基因水稻材料，其中包含的亞細胞定位類型主要有：細胞膜、細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)體、線粒體、高爾基體、液泡、過氧化物酶體及細胞骨架。
　

2、　本研究主要內(nèi)容包括：⑴經(jīng)過潮酶素抗性篩選、PCR驗證、原生質(zhì)體熒光觀察及水稻葉鞘組織熒光觀察，驗證了絕大多數(shù)前期所培育的標記系材料能夠穩(wěn)定表達熒光信號，并且正確定位于預測的細胞器；⑵針對轉(zhuǎn)化pCXSN-RFPAtCCASP、pCXSN-GFPmTn、pCXSN-RFPH2B、pCXSN-RFP等結(jié)構(gòu)的熒光信號弱或未檢測到熒光信號的材料，重新構(gòu)建了以Ubiquitin強啟動子替代35S啟動子驅(qū)動熒光蛋白融合結(jié)構(gòu)表達的載體，并進行了驗證；

3、⑶以穩(wěn)定表達核定位綠色熒光標記GFP-H2B的水稻為例子，將一個水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY45-RFP融合表達結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化到GFP-H2B水稻原生質(zhì)體中，熒光觀察結(jié)果顯示W(wǎng)RKY45-RFP和GFP-H2B共定位于細胞核中，表明本研究所培育的熒光標記系能夠應用于水稻蛋白的亞細胞共定位研究；⑷同樣以GFP-H2B水稻為材料，以表達PWL2-mCherry-NLS的稻瘟菌株pBV591侵染GFP-H2B水稻葉鞘組織，熒光觀察結(jié)果顯示， PWL2-mC