類風(fēng)濕診斷與抗ccp抗體檢測ppt演示課件

1、類風(fēng)濕診斷與抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP抗體）的檢測,anticyclic citrullinated peptide antibodyanti-CCP antibody,概述,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種自身免疫性疾病。由于一方面自身免疫的病理機制決定了這類疾病的疑難和復(fù)雜；另一方面由于這類疾病累及多個系統(tǒng)和器官，臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜。所以RA以往在臨床上更多的表現(xiàn)為“疑難雜癥”。風(fēng)濕性疾病的現(xiàn)狀可以概括為“四多”，累及臟器多；起病首發(fā)

2、表現(xiàn)多；誤診誤治多；致殘多。從而也引發(fā)出另外一多“病人花費多”！由于風(fēng)濕性疾病早期表現(xiàn)不典型，有些疾病有兩種或兩種以上表現(xiàn)相互重疊；同時，風(fēng)濕性疾病存在相互轉(zhuǎn)化的情形；所以風(fēng)濕性疾病的早期診斷有一定的困難。因此，對風(fēng)濕性疾病患者的隨訪和定期檢查顯得尤為重要，這也是驗證我們早期的診斷是否正確的必由之路。正確的早期診斷是采取規(guī)范化治療、提高患者的生活質(zhì)量、改善預(yù)后的前提。,美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）1987分類標(biāo)準(zhǔn),①晨僵;②3個或3個

3、以上關(guān)節(jié)腫脹（軟組織）;③手關(guān)節(jié)腫脹（近端指間關(guān)節(jié)，掌指關(guān)節(jié)或腕關(guān)節(jié)）;④對稱性腫脹（軟組織）;⑤皮下結(jié)節(jié);⑥血清類風(fēng)濕因子陽性;⑦骨關(guān)節(jié)X線片示手或腕關(guān)節(jié)侵蝕性缺損和（或）關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)疏松。以上1～4項必須為醫(yī)師所見，持續(xù)6周或以上，具備上列7項標(biāo)準(zhǔn)中的4項，即可診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。,ACR和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）2009年的RA分類標(biāo)準(zhǔn)和評分系統(tǒng),類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的早期診斷和早期治療已成為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎迫切需要，以往

4、的分類標(biāo)準(zhǔn)不能達到早期診斷的目的，分類標(biāo)準(zhǔn)不等于診斷標(biāo)準(zhǔn)。臨床工作更需要一個可靠的疾病緩解標(biāo)準(zhǔn)（包括臨床緩解與結(jié)構(gòu)進展等問題）。但實際上制定一個早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的分類標(biāo)準(zhǔn)很困難，有人提出了炎性關(guān)節(jié)炎的概念，甚至提出了早期炎性關(guān)節(jié)炎的概念，正是因為這部分患者炎性關(guān)節(jié)炎不是全部，而是部分發(fā)展為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，在新的分類標(biāo)準(zhǔn)中如果判斷有可能發(fā)展為持續(xù)炎性關(guān)節(jié)炎或破壞性關(guān)節(jié)炎，這類關(guān)節(jié)炎就被認(rèn)為是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。,2009年的RA分類標(biāo)準(zhǔn)和評分系統(tǒng)

5、,必要條件 至少一個關(guān)節(jié)腫痛，并有滑膜炎的證據(jù)（臨床或超聲或磁共振成像）在未分化關(guān)節(jié)炎中需要排除其他疾病引起的關(guān)節(jié)炎癥狀和體征。,,其他條件 ①血清學(xué)：抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（CCP）和類風(fēng)濕因子（RF）;②受累關(guān)節(jié)的種類（小或大關(guān)節(jié)）和數(shù)量;③滑膜炎的病程;④急性血象反應(yīng)：紅細(xì)胞沉降率（ESR）和C-反應(yīng)蛋白（CRP）。,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷,診斷第一步 滿足2項必要條件，并有常規(guī)典型放射學(xué)RA骨破壞的改變，可明確診斷為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，,類

6、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷,診斷第二步 如沒有常規(guī)典型放射學(xué)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞的改變，需要進入以下分類評分系統(tǒng)，請記住以下分值表中的得分。不同的關(guān)節(jié)受累情況再加上區(qū)域辨別條件中的任何項目，評分大于6分提示為確定的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,ACR和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）2009年的RA分類標(biāo)準(zhǔn)和評分系統(tǒng),受累關(guān)節(jié)數(shù) 分值（0~5分）1   &#

7、160;       中大關(guān)節(jié) 02~10        中大關(guān)節(jié) 11~3         小關(guān) 節(jié)

8、 24~10        小關(guān)節(jié) 3>10         至少一個為小關(guān)節(jié) 5血清學(xué)抗體檢測

9、 （0~3分）RF或抗CCP均陰性 0RF或抗CCP至少一項低滴度陽性 2RF或抗CCP至少一項高滴度陽性 3滑膜炎持續(xù)時間 （0~1分）<6周

10、 0≧6周 1急性期反應(yīng)物 （0~1分）CRP或ESR均正常 0CRP或ESR增高

11、 16分或以上肯定RA診斷,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷,診斷第三步 樹枝計算法，根據(jù)關(guān)節(jié)受累情況：①》10個關(guān)節(jié)（至少1個小關(guān)節(jié)）;②4～10個小關(guān)節(jié);③1～3個小關(guān)節(jié);④2～10個中大關(guān)節(jié);按圖2是或否繼續(xù)分類。樹枝計算法用文字描述：①如滿足受累關(guān)節(jié)大于10個關(guān)節(jié)（至少1個小關(guān)節(jié)）（5分）同時滿足血清學(xué)陽性（或滑膜炎病程≥6周，或ESR/CRP升高），評分≥6分;②如滿足4～10個

12、小關(guān)節(jié)受累（3分）同時需要滿足血清學(xué)高滴度陽性，或血清學(xué)低滴度陽性+滑膜炎病程≥6周（或+ESR/CRP升高），評分≥6分;,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷,③如滿足1～3個小關(guān)節(jié)受累（2分）同時需要滿足血清學(xué)高滴度陽性+滑膜炎病程≥6周（或+ESR/CRP升高），或血清學(xué)低滴度陽性+滑膜炎病程≥6周+ESR/CRP升高，評分≥6分;④如滿足2～10個中大關(guān)節(jié)受累（1分）同時需要滿足血清學(xué)高滴度陽性+滑膜炎病程≥6周+ESR/CRP升高，評分≥6分

13、。所以只要滿足以上任何一種情況，即提示為確定的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。,實驗室檢查,目前臨床上對于RA的疑似患者所采取的初步篩查實驗室檢測手段多為常規(guī)風(fēng)濕四項，為血沉檢測（ESR）、C反映蛋白檢測（CRP）、類風(fēng)濕因子檢測（RF）、抗“O”檢測（ASO）。ESR和CRP與RA的活動性有關(guān)，其檢測結(jié)果受多因素的影響，故只作為病情活動性的參考指標(biāo)；ASO是一項排除性指標(biāo)。這三項檢測對于RA疑似患者的早期診斷意義不大。RF是目前最為常用的RA診斷指標(biāo)，

14、但目前常用的RF檢測多為檢測IgM型，而IgM-RF在RA診斷中的敏感性只有40～70%，特異性只有70%左右，同時尚可見于5%的正常老年人、其它自身免疫性疾病、肝炎、結(jié)核等疾病。RF陰性并不能排除RA的診斷，約30%的早期RA患者RF為陰性。所以單純依靠常規(guī)風(fēng)濕四項檢測對于RA作出早期診斷并指導(dǎo)臨床治療還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。,實驗室檢查,近年來形成了一些敏感性和特異性都非常高的RA診斷技術(shù)，如抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（CCP）檢測、抗角蛋白抗體（AKA

15、）檢測、抗RA33/RA36抗體檢測、抗Sa抗體檢測、抗核周因子抗體檢測等。以上抗體中兩項同時陽性者RA的可能性高達91.3%。其中，抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體檢測對早期RA診斷的敏感性和特異性高，是目前最常用的早期診斷指標(biāo)。,抗CCP抗體的定義：,一種自身抗體。是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特異而敏感的早期診斷指標(biāo)，可鑒別侵蝕性、非侵蝕性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，陽性者通常出現(xiàn)或易發(fā)展為嚴(yán)重的關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞。 抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（CCP）是環(huán)狀聚絲蛋白的多肽片

16、段，是以IgG型為主的抗體，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）具有很好的敏感性和特異性，且抗CCP抗體陽性的RA病人骨破壞較抗CCP抗體陰性者嚴(yán)重。,研究簡史,抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（CCP）ELISA法是1998年Schellkens等建立起來輔助診斷RA的檢測方法，該技術(shù)一出現(xiàn)，立即備受關(guān)注，現(xiàn)已有商品供應(yīng)。按照前絲集蛋白cDNA序列，人工合成可能具有抗原表位的9~19個氨基酸短肽，并經(jīng)胍氨酸化修飾，經(jīng)ELISA篩選出具有抗原性片段。,檢測方法,現(xiàn)

17、有ELISA法、增強化學(xué)發(fā)光法、膠體金法目前國內(nèi)已有許多廠家有商品試劑盒供應(yīng)。,ELISA檢測原理,應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中CCP水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入CCP抗原、生物素化的抗人CCP抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CCP呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定

18、吸光度(OD值)，計算樣品濃度。 檢測范圍：3.9 ng/ml -250 ng/ml,增強化學(xué)發(fā)光法 原理,利用抗原抗體特異性結(jié)合及酶底物L(fēng)uminol發(fā)光體系定量檢測CCP。  1．靈敏度：10U/ml    2．特異性：與1mg/ml的脂蛋白、25mg/ml的球蛋白、0.1mg/ml的血紅蛋白、0.1μg/ml的透明質(zhì)酸、2mg/ml的粘蛋白、0.05mg/ml的

19、β2-微球蛋白不發(fā)生交叉反應(yīng)。    3．精密度：批內(nèi)CV值小于10%、批間CV值小于15%。    4．線性范圍：0～160U/ml,膠體金法 原理,采用膠體金免疫層析技術(shù)，以間接法檢測血清中的自身抗體。檢測結(jié)果：陰性、陽性,標(biāo)本的采集及保存,1.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。2.

20、0; 血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。,ELISA操作注意事項,1.洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。2. 一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)

21、，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。3. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。4. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請最后乘以稀釋倍數(shù)。5.  在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。6. 底物請避光保存,臨床應(yīng)用,1．敏感性和特異性：抗CCP抗體與RF具有相同的敏感性（抗CCP抗體：80％ ，RF：79％），但特異性更高（抗CCP抗體

22、：96％，RF：63％）。2．可應(yīng)用于ＲＡ早期診斷：研究發(fā)現(xiàn)抗ＣＣＰ抗體與早期ＲＡ強相關(guān)，在79％的早期患者中可檢出抗CCP抗體，陽性預(yù)測值為 84%。3．區(qū)別RA和其它風(fēng)濕性疾?。海樱蹋?系統(tǒng)性紅斑狼瘡 )和ＲＡ在早期 ,有時候都會出現(xiàn)小關(guān)節(jié)侵蝕性病變 ,研究發(fā)現(xiàn)抗ＣＣＰ抗體在區(qū)別早期ＲＡ和早期侵蝕性小關(guān)節(jié)病變的ＳＬＥ時有很重要的價值。4．抗ＣＣＰ抗體對ＲＡ預(yù)后的價值：抗ＣＣＰ抗體陽性是侵蝕性關(guān)節(jié)損害的一個重要標(biāo)志及危險因素，抗