組培過程中的玻璃化問題

1、組培過程中的玻璃化問題組培過程中的玻璃化問題在進行植物組織培養(yǎng)時，經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)試管苗生長異常，表現(xiàn)為試管苗葉、嫩梢呈水晶透明或半透時，水浸狀；整株矮小腫脹、失綠；葉片皺縮成縱向卷曲、脆弱易碎；葉表缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織。這種試管苗生長異?，F(xiàn)象就是P.Debergh（1981）首先命名的“玻璃化”（Vitrification）。是植物組織培養(yǎng)過程中所特有的一種生理失調(diào)或生理病變。玻璃苗中因其體內(nèi)含水量高

2、，干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和森質(zhì)素含量低、角質(zhì)層、柵欄組織等發(fā)育不全，表現(xiàn)為光合能力和酶活性降低，組織畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很難繼續(xù)用作繼代培養(yǎng)和擴大繁殖的材；生根困難，移栽后也很難成活。植物微體快速繁殖時玻璃苗的出現(xiàn)已成為一種很普遍的現(xiàn)象，該苗有時多達50%以上，嚴重影響繁殖率的提高，已成為莖尖脫毒、工廠化育苗和材料保存等方面的嚴重障礙，造成人、財、物的極大浪費，所以試管苗下班化現(xiàn)象對植物組織培養(yǎng)的危害是相當嚴重

3、的，也是亟待解決的問題。（一）玻璃苗發(fā)生的因素瓊脂和蔗糖濃度與玻璃化成負相關(guān)，瓊脂或蔗糖濃度越高，玻璃苗的比率越低。DanielG.W.Brown認為玻璃化可能是培養(yǎng)基滲透勢不當所致。碳源不僅為芽的形成提供能量，而且也起滲透調(diào)節(jié)作用，主要影響培養(yǎng)基的滲勢（Salisbury等）。隨瓊脂濃度及純度的增加，培養(yǎng)基硬度增加，從而影響其襯質(zhì)勢和水分狀況。Debergh等研究表明，液體培養(yǎng)基的水勢影響玻璃苗的形成，Ziv等認為只要降低培養(yǎng)容器中的

4、相對濕度，就可以降低玻璃苗的比例。劉思穎等（1988）測得絲石竹玻璃苗葉片的水勢約為正常苗的1.9倍，含水量為正常苗的2.09倍—2.21倍。自由水和高濕度可能與肉質(zhì)嫩梢的形成有關(guān)。Davis等研究表明，液體培養(yǎng)是導(dǎo)致玻璃化的主要原因。可以斷定，試管苗玻璃化可能是培養(yǎng)基內(nèi)水分狀態(tài)不適應(yīng)的一種生理變態(tài)。許多學(xué)者證明培養(yǎng)基中BA濃度和培養(yǎng)溫度與玻璃化成正相關(guān)，BA濃度越高或培養(yǎng)溫度越高，玻璃苗比率越大。Debergh曾用14CKT研究表明，

5、隨瓊脂濃度的增加，KT利用率降低。同時也證明，隨BA濃度的增加，玻璃化率增加。Bnman等用14CBA研究表明，14CBA的積累與不定芽分化和玻璃化是同步的。玻璃化苗的一個重要特征是葉脈明顯加長，而GA3也有類似效應(yīng)，也許GA3促進了細胞過度生工，從而導(dǎo)致玻璃化。生長素可以改變細胞壁的機械特性，使其具有更大的可塑性。許多研究表明，非受傷的物理和化學(xué)協(xié)迫可以增加乙烯的合成。玻璃化被認為是一種非受傷協(xié)迫條件下形態(tài)上的反應(yīng)。玻璃苗苯丙氨酸解氨

6、酶（PAL）的活性低于正常植株。在協(xié)迫條件下乙烯的快速合成，又通過抑制氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）酶的形成，對乙烯起反饋調(diào)節(jié)作用。通過改善氣體交換防止玻璃化形成，可能與克服乙烯反饋抑制有關(guān)。一種與膜有關(guān)的過氧化物酶直接或間接摻入ACC合成乙烯?，F(xiàn)已證明，IAA氧化酶體系至少在乙烯合成的最后一步起作用。IAA含量降低將進一步通過IAA調(diào)節(jié)S腺苷甲硫氨酸（SAM）轉(zhuǎn)化成ACC這一過程，從而降低了乙烯形成。Kevers等曾證明，對于玻璃苗，堿性過

7、氧化酶同功酶活性增加，而酸性同功酶活性降低。但總可溶性過氧化物酶活性增加，僅限于堿性提取物。有人認為，玻璃化的形成主要是膜的效應(yīng)而與核酸無關(guān)。乙烯促進了葉綠素分解及細胞的畸形發(fā)展。乙烯處理破壞了膜的結(jié)構(gòu)，隨著細胞壁解離，細胞內(nèi)積累有在量纖維素及泡狀物質(zhì)?？梢?，乙烯對玻璃化的影響，與改變組織的生理生化及纖維結(jié)構(gòu)有關(guān)。HakkartF.A.等認為玻璃苗是培養(yǎng)瓶內(nèi)氣體與外界交換不暢造成的。密閉的封瓶口材料是導(dǎo)致玻璃化的原因之一（陳國菊等199

8、2，李云等1996）。培養(yǎng)基中高的含N量，特別是高的氨態(tài)N，也是導(dǎo)致玻璃化的因素。有人發(fā)現(xiàn)不同部位的節(jié)段外植體與玻璃化有關(guān)，以留蘭香基部節(jié)段所形成的試管苗玻璃苗嚴重，中部莖段次之，莖尖最好（柴明良）；重瓣絲石竹中部莖段出現(xiàn)玻璃苗較多，基部莖段較少，莖尖沒有（郭達初）。郭東紅等（1989）認為瑞香莖尖外植體大小與玻璃化相關(guān)，莖尖外植體越小，出現(xiàn)玻璃苗比率越大。（二）玻璃苗發(fā)生的機理Kevers等的試驗表明，蘋果砧木M7等的玻璃苗是由于過氧

9、化物酶——吲哚乙酸氧化酶系統(tǒng)控制的乙烯過飽和的影響，并認為細胞激動素和NH4離子的過剩是一種最初的脅迫，受脅迫的試管苗在乙烯過剩的空氣中，抑制了乙烯的生物合成，結(jié)果降低苯丙氨酸解氨酶（PAL）和酸性過氧化物酶的活性，從而妨礙組織木質(zhì)化，導(dǎo)致形成玻璃苗。一種誘導(dǎo)協(xié)迫（過多的細胞分裂素和NH4），可以通過酚含量的快速化調(diào)節(jié)不斷增加的過氧化物酶活性。乙烯的大量形成又對其自身起反饋抑制作用，結(jié)果PAL和酸性過氧化物酶活性降低，從而抑制木質(zhì)化過程

10、的進行。糖用于氨基酸的合成，纖維素含量降低。由于缺乏纖維素和木質(zhì)素，壁壓降低，從而細胞過分吸水，并導(dǎo)致玻璃化。張洪勝等認為在試管苗玻璃化過程中，作為內(nèi)源激素的乙烯從代謝調(diào)節(jié)上起了關(guān)鍵性啟動作用。而乙烯的產(chǎn)生則取決于培養(yǎng)環(huán)境中的脅迫條件，如水勢不當，通氣不暢（造成缺氧）及培養(yǎng)基用BA量過高等，均會導(dǎo)致乙烯產(chǎn)生。乙烯產(chǎn)生后引發(fā)了其他激素質(zhì)和量上的改變及酶類的變化。因此，發(fā)生蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素的合成障礙及降解，葉綠素分解黃化，逐漸形成玻璃

11、化癥狀；張昆瑜等（1991）認為乙烯克服試管苗玻璃化的機理是復(fù)雜的，在添加乙烯前體ACC（1氨基環(huán)丙烷1羧酸）和乙烯釋放劑CEPA（乙烯利）的培養(yǎng)基上許多植物的組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)有褐變現(xiàn)象，尤以木本植物組織培養(yǎng)中褐變嚴重。褐變主要發(fā)生在外植體、愈傷組織的繼代、懸浮細胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)等。褐變產(chǎn)物不僅使外植體、細胞、培養(yǎng)基等變褐，而且對許多酶有抑制作用，從而影響培養(yǎng)材料的生長與分化，嚴重時甚至導(dǎo)致死亡。[1]褐變的機理正常細胞內(nèi)，區(qū)

12、域性分布使底物與PPO不能接觸并不發(fā)生褐變，當細胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和破壞時，酶和底物就結(jié)合在一塊，在氧的作用下，生成醌，從而引起褐變。引起褐變的條件：氧、引起褐變的酶、底物，缺一不可。引起褐變的酶：多酚氧化酶（PPO是主要的）、過氧化物酶（POD）、、苯丙氨酸解氨酶等。引起褐變的酶的底物：主要是酚類化合物，可分成3類：第一類是苯基羧酸，包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等；第二類是苯丙烷衍生物，包括肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木

13、質(zhì)素等；第三類是黃烷衍生物，包括花青素、黃酮、蕓香苷等。[2]影響褐變的因素因子是復(fù)雜的，隨植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態(tài)等的不同，褐變的程度也有所不同。A.植物種類及基因型紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)過程中，常常發(fā)生培養(yǎng)細胞褐變現(xiàn)象，輕者影響細胞生長和繁殖，重者導(dǎo)致細胞死亡。豆科植物和蕓苔屬植物原生質(zhì)體培養(yǎng)中容易褐化也是一個普遍的問題，橡膠的花藥培養(yǎng)中，海墾2號花藥的褐變較少，因而愈傷組織的誘導(dǎo)容易；而有些品系花藥容易褐變

14、，因而愈傷組織的誘導(dǎo)困難。在組織培養(yǎng)中，有些品種、品系難以成功，而有些則容易成功。油菜葉原生質(zhì)體品種373褐化比品種94591、95386嚴重B.外植體部位及生理狀態(tài)荔枝莖的愈傷組織中度褐變，而根的愈傷組織全部褐變。歐洲栗幼年型的材料培養(yǎng)時含醌類物質(zhì)少，成年型材料培養(yǎng)時含醌類物質(zhì)多，后者比前者褐變嚴重。油棕幼嫩外植體（如胚）培養(yǎng)較少褐變，高度分化的葉片接種后則容易褐變。C.培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件硬紫草從長期繼代培養(yǎng)且次生代謝物含量高引起培

15、養(yǎng)物的褐變。用B5培養(yǎng)基可有效地防止褐變。茼蒿用甘露醇或蔗糖作為滲透壓調(diào)節(jié)劑易發(fā)生褐變，不能或只能形成少量細胞團用葡萄糖作滲透壓調(diào)節(jié)劑褐變較少，效果好。柿樹ZT9.13μmolL、IAA0.57μmolL減輕褐變程度。BA或KT提高了褐變甘蔗組織培養(yǎng)中易產(chǎn)生褐變。荔枝培養(yǎng)基添加1mgL6BA0.5mgL24D時，愈傷組織較硬、增殖緩慢、易褐變；培養(yǎng)基添加1mgL6BA1mgL24D時，愈傷組織淺黃疏松、增殖快[4]。D.pH值影響材料的

16、褐變大白菜pH值至6.5，很大程度上可抑制褐變。水稻pH值為4.5～5.0時，生長狀態(tài)良好的，其表面呈黃白色，pH值為5.5～6.0時，愈傷組織嚴重褐變。E.培養(yǎng)條件不適宜溫度過高或光照過強，均可使PPO的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的組織褐變。高濃度CO2也會促進褐變，其原因是環(huán)境中的CO2向細胞內(nèi)擴散，使細胞內(nèi)CO32增多，產(chǎn)生褐變。[3]克服褐變的方法a.選擇適當?shù)耐庵搀w成年植株比實生幼苗褐變的程度嚴重，夏季材料比冬季及早春和秋季的材