pcr技術的基本原理

1、PCR技術的基本原理：該技術是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3OH末端，并以此為起始點，沿模板5→3方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。PCR目錄〔PCR原理〕PCR反應體系與反應條

2、件〔PCR步驟〕〔PCR檢測〕〔PCR反應特點〕[PCR儀器]聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復制。DNA聚合酶（DNApolymeraseI）最早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實驗價值及實用性的KlenowfragmentofE.Coli則是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變

3、性因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應?，F(xiàn)今所使用的酶(簡稱Taqpolymerase)則是于1976年從溫泉中的細菌（Thermusaquaticus）分離出來的。它的特性就在于能耐高溫，是一個很理想的酶，但它被廣泛運用則于80年代之后。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復復制，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他發(fā)表了第一個單純且短暫性基因復制（類似PCR前兩個周期反應）的實驗。而現(xiàn)今所發(fā)展出來的PCR則于19

4、83由Dr.KaryB.Mullis發(fā)展出的，Dr.Mullis當年服務于PE公司，因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr.Mullis并于1985年與Saiki等人正式表了第一篇相關的論文。此后，PCR的運用一日千里，相關的論文發(fā)表質(zhì)量可以說是令眾多其它研究方法難望其項背。隨后PCR技術在生物科研和臨床應用中得以廣泛應用，成為分子生物學研究的最重要技術。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學獎。[編輯本段]〔PCR原理〕DN

5、A的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅

6、操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性退火延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至9

7、3℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=1012)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=6)水平。能從100萬個細胞中檢出

8、一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。簡便、快速PCR反應用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性退火延伸反應，一般在2～4小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。對標本的純度要求低不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液

9、、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測?！睵CR的循環(huán)參數(shù)〕1、預變性（Initialdenaturation）模板DNA完全變性對PCR能否成功至關重要，一般95℃加熱35分鐘。2、引物退火（Primerannealing）退火溫度一般需要憑實驗（經(jīng)驗）決定。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。3、引物延伸引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。延伸時間隨擴增片段長短而定。4、循環(huán)中的變性步驟循環(huán)中一般95℃，30秒足以使

10、各種靶DNA序列完全變性：變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。5、循環(huán)數(shù)大多數(shù)PCR含2535循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴增。6、最后延伸在最后一個循環(huán)后，反應在72℃維持515分鐘使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。（四）PCR中的污染和假陽性PCR中污染主要來自1、樣品間交叉污染；2、先前PCR產(chǎn)物遺留（carryover）[編輯本段][PCR儀器]pcr儀器的發(fā)展pcr溫度循環(huán)至關重要，pcr擴增儀各參數(shù)