異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離鑒定及熒光標(biāo)記和關(guān)鍵酶基因研究.pdf

1、氮元素污染物是造成水體污染和富營養(yǎng)化的主要原因之一。一般認(rèn)為，生物脫氮要經(jīng)過硝化作用和反硝化作用兩個過程。而自養(yǎng)型硝化細(xì)菌在硝化作用過程中占據(jù)主要地位。但近來的研究表明，有些異養(yǎng)微生物也能進(jìn)行硝化作用，如脫氮副球菌（Paracoccus denitrificans）和惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）等。
　　 本文新分離得到了一株異養(yǎng)硝化菌LYS-86。根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化特性鑒定及16S rDNA的同

2、源性分析結(jié)果，將其初步鑒定為Pseudomonas stutzeri。經(jīng)單因素試驗(yàn)，菌株LYS-86氧化亞硝酸鹽的最適pH，溫度，轉(zhuǎn)速，鹽濃度分別為8.0～10.0，30℃，180 rpm和1 g/L。當(dāng)培養(yǎng)基中初始亞硝酸鹽濃度為0.5g/l時，菌株LYS-86的硝化活性最高，隨著培養(yǎng)基中初始亞硝基氮濃度的不斷提高，菌株LYS-86的硝化活性不斷下降。
　　 為便于實(shí)時監(jiān)測和考察異養(yǎng)硝化菌LYS-86生物膜的形成與變化情況，需要

3、構(gòu)建熒光標(biāo)記菌株。本文首先構(gòu)建了帶有綠色熒光蛋白基因的重組自殺性載體pUT/mini-Tn5-Km2-GFP，再通過該質(zhì)粒的介導(dǎo)作用將綠色熒光蛋白基因整合到菌株LYS-86的染色體上，以使其獲得穩(wěn)定的熒光表型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pUT/mini-Tn5-Km2-GFP已經(jīng)構(gòu)建成功。該質(zhì)粒上的綠色熒光蛋白基因也能在Ecoli S17-λpir中得到了表達(dá)。隨后通過雙親本濾膜接合作用，在加有適當(dāng)濃度的卡那霉素的硝化培養(yǎng)基上篩選得到了多株陽性接合子

4、。取其中兩株P(guān)CR鑒定正確的陽性接合子在熒光顯微鏡下觀察其熒光表型。發(fā)現(xiàn)整合進(jìn)染色體上的綠色熒光蛋白基因并未在這些結(jié)合子中獲得表達(dá)。這可能是由于乳糖啟動子在接合子中沒有發(fā)揮作用從而沒有成功啟動下游的熒光蛋白基因的表達(dá)而造成的。
　　 本文同時根據(jù)假單胞菌屬中amoA基因的兩個保守的區(qū)域設(shè)計了一對簡并引物，從另一株異養(yǎng)硝化細(xì)菌Pseudomonas putida xyzPCR獲得了一條長817bp的基因片段。該基因片段與已報道的菌

5、株P(guān)seudomonas putida目的amoA基因有較高的同源性，同源性達(dá)到了94％。根據(jù)菌株P(guān)seudomonas putida目的amoA基因序列設(shè)計了一對特異性引物，PCR獲得了一段長1056 bp的基因片段，該基因片段編碼351個氨基酸。該基因片段編碼的amoA與菌株P(guān)seudomonas putidaF1，Pseudomonas entomophila L48，Pseudomonas fluorescens Pf-5以及P