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文檔簡(jiǎn)介
1、植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的組成、儀器設(shè)備及基本操作,一、植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)構(gòu)及設(shè)計(jì)要求: 完整的植物組織培養(yǎng)室通常包括洗滌室、化學(xué)實(shí)驗(yàn)室、接種室、培養(yǎng)室、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室等部分??梢愿鶕?jù)實(shí)際需要和條件進(jìn)行設(shè)計(jì)。 但從功能上至少包括準(zhǔn)備室(化學(xué)實(shí)驗(yàn)室)、接種室以及培養(yǎng)室三部分,并且按順序排列。 在化學(xué)實(shí)驗(yàn)室與接種室之間應(yīng)留有緩沖空間。,第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)、儀器設(shè)備及操作技術(shù),(一)準(zhǔn)備室(化學(xué)實(shí)驗(yàn)室): 1.
2、 主要功能: 用于培養(yǎng)器皿的清洗、干燥、培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌、試管苗的出瓶及整理等工作。,2. 主要儀器設(shè)備及用品: 藥品柜、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、水槽、超聲波洗滌儀、涼干架、干燥箱、各種玻璃器皿(燒杯、量筒、容量瓶、試劑瓶、三角瓶等)、蒸餾水制造裝置。 天平、移液器、 pH計(jì)、水浴鍋、微波爐、電爐、磁力攪拌器、蠕動(dòng)泵、及培養(yǎng)基分裝用品等、高壓滅菌鍋、 冰箱。,(二)接種室(無菌操作室): 1、功能:
3、 接種材料的滅菌、接種以及培養(yǎng)物的繼代轉(zhuǎn)接等。 接種室要求保持潔凈,與化學(xué)實(shí)驗(yàn)室之間應(yīng)設(shè)置緩沖室。,,2、儀器設(shè)備及用品: 超凈工作臺(tái)、紫外燈、小推車、擱架、磁盤、接種工具(各種鑷子、解剖刀、手術(shù)剪、普通剪刀接種針、酒精燈、手持噴霧器、細(xì)菌過濾器等)等。,(三)培養(yǎng)室: 1、功能: 主要用于植物材料的培養(yǎng)。 要求室內(nèi)潔凈并能保持一定的溫度、光照以及濕度,以促進(jìn)植物材料的生長(zhǎng)和分
4、化。,2、儀器設(shè)備及用品: 培養(yǎng)架及燈管、搖床(振蕩器)、空調(diào)、自動(dòng)定時(shí)器、加濕及除濕器、光照培養(yǎng)箱等。,(四)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室: 1、功能: 主要用于培養(yǎng)材料的顯微觀察及照相等。,2、儀式設(shè)備及用品: 體視顯微鏡、普通顯微鏡、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、配套顯微照相裝置、普通相機(jī)或數(shù)碼相機(jī)、切片機(jī)及配套制片及染色用品等。,體視顯微鏡,,用途:放大倍數(shù)5~80倍主要用于植物形態(tài)分化的觀察、莖尖的切取。,普
5、通光學(xué)顯微鏡,用途:用于植物切片觀察,確定植物的發(fā)育進(jìn)程,如:不定芽、不定胚的分化過程以及其它器官組織的分化等。,倒置顯微鏡,用途:主要用于細(xì)胞、原生質(zhì)體的細(xì)胞分裂和細(xì)胞團(tuán)形成的觀察。,(一)洗滌: 1. 普通器皿:采用洗衣粉、洗潔精等中性洗滌劑洗滌。 2. 難清洗器皿及移液管等:用水清洗后再用重鉻酸鉀洗液浸泡,最后清水沖洗,或用超聲波儀清洗。,重鉻酸鉀洗液的配制方法:43g重鉻酸鉀溶于1000ml蒸餾水中,將濃硫酸緩慢
6、倒入重鉻酸鉀溶液中,濃度比例為1:1。,二、實(shí)驗(yàn)室基本操作:,1、器具滅菌:培養(yǎng)皿、解剖刀、鑷子等用品。 (1)干熱滅菌:鋁箔包好后,放于恒溫干燥箱內(nèi),150 ℃保溫2小時(shí),成本較高。 (2)高壓蒸汽滅菌:高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)120 ℃ 15-20分鐘 。 (3)灼燒滅菌:接種時(shí),解剖刀及鑷子等浸入95%乙醇,然后取出在酒精燈火焰上灼燒殺菌。,(二)滅菌: 滅菌 是指用物理和化學(xué)方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有微生物(包
7、括芽胞),使之呈無菌狀態(tài)。經(jīng)過滅菌的物品稱“無菌物品”。,,2、培養(yǎng)基滅菌: 采用高壓蒸汽滅菌。120℃ 15-20分鐘。 培養(yǎng)基體積越大,滅菌時(shí)間越長(zhǎng)。,高溫高壓滅菌對(duì)培養(yǎng)基成分的影響: a.pH值普遍下降?!.產(chǎn)生混濁或沉淀,這主要是由于一些離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生混濁或沉淀。例如Ca+2與PO4-3化合,就會(huì)產(chǎn)生磷酸鈣沉淀?!.不少培養(yǎng)基顏色加深?!.體積和濃度有所變化?!.營(yíng)養(yǎng)成分有時(shí)受到破壞。
8、,3、不耐高溫材料的滅菌: 采用過濾滅菌,如IAA、ZT、天然有機(jī)添加物等。,4、外植體的表面滅菌: 采用70-75%乙醇(10-30秒)、有效氯1%的次氯酸鈉(5-30分鐘)、0.1-0.2%的氯化汞(2-15分鐘)等殺菌劑中加入幾滴吐溫-20或80(Tween-20或80)效果較好。,(三)無菌操作: 1、保持接種室的無污染環(huán)境,定期熏蒸或噴霧處理。接種前打開超凈工作臺(tái)及紫外燈照射20-30分鐘,關(guān)閉紫外等燈后
9、使氣體散出后開始操作。 2、保持超凈工作臺(tái)的潔凈:接種前用70%乙醇擦拭臺(tái)面或用噴壺噴霧,操作前,將手和手臂用70%乙醇消毒,所需試驗(yàn)用品用乙醇擦拭后放入超凈工作臺(tái)。,3、點(diǎn)燃酒精燈,進(jìn)行操作,接種材料前后,灼燒瓶口,工具要灼燒徹底,防止交叉污染。4、保持培養(yǎng)室的潔凈,發(fā)現(xiàn)污染及時(shí)挑出,以減少污染源。5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽,出入接種室換拖鞋以保持接種室的潔凈。,第二章 植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的組成、儀器設(shè)備及基本操作,
10、第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)、儀器設(shè)備及操作技術(shù) 一、植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)構(gòu)及設(shè)計(jì)要求 二、 實(shí)驗(yàn)室基本操作,第二章 植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的組 成、儀器設(shè)備及基本操作,第二節(jié) 培養(yǎng)基的組成、配制與滅菌,一、培養(yǎng)基(medium)的組成和作用,通常植物組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基包括以下六大類成分,即礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、有機(jī)成分、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、碳源、瓊脂以及其他附加物等。,培養(yǎng)基的主要指標(biāo)是: 營(yíng)養(yǎng)成
11、分的濃度 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度,(一)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng): 礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)又稱無機(jī)營(yíng)養(yǎng),是指植物生長(zhǎng)發(fā)育所需要的各種化學(xué)元素。,礦質(zhì)元素的生理作用:(1)組成各種化合物,成為結(jié)構(gòu)物質(zhì);(2)許多酶和附酶的組成部分,參與代謝;(3)維持離子平衡、膠體穩(wěn)定及電荷平衡等電化學(xué)作用;(4)影響形態(tài)發(fā)生和組織、器官的建成等。,根據(jù)植物對(duì)元素的吸收量,可以把植物必需元素分為大量元素和微量元素。 國(guó)際植物生理
12、學(xué)會(huì)規(guī)定植物所需濃度大于0.5 mmol/l的的元素稱為大量元素。低于0.5 mmol/l的元素稱為微量元素。 大量元素:C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 分別占植物干重的百分?jǐn)?shù)為18%、10%、70%、0.3%、0.07%、0.3%、0.3 %、0.07%、0.05%。 微量元素:Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等。,1、大量元素: N、P、K、Ca、Mg、S等6種大量元素依靠各種無機(jī)鹽提供。
13、 不同植物種類和不同試驗(yàn)?zāi)康膶?duì)元素的使用量要求不同,需經(jīng)試驗(yàn)確定。 目前已選擇出多種培養(yǎng)基配方用于植物組織培養(yǎng)。其中以MS應(yīng)用最廣泛。 以MS為例6中礦質(zhì)元素分別由KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO47H2O、CaCl24H2O提供。,,大量元素中的氮通常采用硝態(tài)氮或銨態(tài)氮,但銨態(tài)氮濃度過高會(huì)對(duì)有些植物的培養(yǎng)物造成傷害,不適宜使用過高的濃度,可以用谷氨酸、絲氨酸等來代替。,2、微量元素: 植物組織的對(duì)其需要量
14、極少,過多會(huì)產(chǎn)生毒害,如造成蛋白質(zhì)變性、酶失活,代謝障礙等。 各種微量元素均具有特定的生理功能,如硼與蛋白質(zhì)的合成及糖類的運(yùn)輸有關(guān);銅能促進(jìn)離體根的形成;錳參與植物的光合作用和呼吸作用;鉬為氮素代謝的重要元素。,微量元素中,鐵的用量較大,它對(duì)葉綠素的合成起重要作用,由于在較高pH下,F(xiàn)eCl3極易形成Fe(OH)3沉淀,難以被吸收,所以多用乙二胺四乙酸二鈉鹽與硫酸亞鐵形成的螯合物,并且單獨(dú)配制。,(二)有機(jī)成分: 主要包括各種
15、維生素和氨基酸 常用的維生素:硫胺素(VB1)、吡哆醇(VB6)、煙酸(VB3)、泛酸鈣(VB5)、生物素、鈷胺素(VB12)、葉酸等。 常用的氨基酸:甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。 有時(shí)添加水解乳蛋白或水解酪蛋白,為牛乳經(jīng)酶法加工的水解產(chǎn)物,含有20種氨基酸的混合物,用量10-1000mg/L, 通常用于原生質(zhì)體等培養(yǎng)。 此外肌醇是另外一種重要的有機(jī)成分,在維持離子平衡,
16、糖類的轉(zhuǎn)化中起重要作用,此外還參與磷脂代謝及等生理作用。它可以促進(jìn)愈傷組織的形成,不定芽、不定胚的分化。,(三)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì): 植物激素是植物代謝中產(chǎn)生的天然化合物,它能直接影響植物細(xì)胞的分化、分裂以及影響植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實(shí)、成熟、衰老脫落、休眠、萌發(fā)等生理活動(dòng)。 在植物組織培養(yǎng)中,主要通過植物激素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)離體的組織、器官的形態(tài)發(fā)生進(jìn)行調(diào)控。包括誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、愈傷組織的生長(zhǎng)、根芽的分化以及體細(xì)胞胚胎發(fā)生等
17、。,常用的植物激素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物涉及五大類植物激素:1、生長(zhǎng)素類:2、細(xì)胞分裂類:3、赤霉素類:4、脫落酸:5、多胺6、乙烯:,1、生長(zhǎng)素類: 組織培養(yǎng)中的功能是:促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂,誘導(dǎo)形成愈傷組織,促進(jìn)生根。 常用的有NAA、IAA、IBA、2,4-D等。,2、細(xì)胞分裂素類: 功能:誘導(dǎo)芽的分化、促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā);促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大,促進(jìn)莖增粗,抑制莖伸長(zhǎng);延緩衰老。 常用細(xì)胞分裂素有BA、KT、ZT
18、、2ip等。,此外近年來發(fā)現(xiàn)苯基脲衍生物具有非常高的細(xì)胞分裂素活性,在多種植物上應(yīng)用。 如TDZ,CPPU,4-PU等。,3、赤霉素類: 主要具有誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長(zhǎng),對(duì)根無效;對(duì)形成層細(xì)胞分化有影響,與生長(zhǎng)素協(xié)同作用;可以誘導(dǎo)離體成花;打破休眠等功能。 常用GA3、GA4等。,4、脫落酸(ABA): 促進(jìn)休眠、衰老和脫落。組織培養(yǎng)中較少使用,主要用于種質(zhì)資源的離體保存。,5、乙烯: 主要促進(jìn)衰老和脫落,高濃度易形態(tài)變
19、化。,(四)碳源: 碳源主要為細(xì)胞提供合成新化合物的骨架,為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物與能源,此外還能維持一定的滲透壓。 常用的碳源主要是蔗糖,使用濃度在10-50g/L,此外果糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物組織培養(yǎng)。,(五)瓊脂: 瓊脂作為固化劑用于組織培養(yǎng)中,起支持植物的作用,不提供營(yíng)養(yǎng),為海藻中提取的一種高分子化合物,僅溶于熱水(90 oC以上),成為凝膠,冷卻后(40 oC以下)即凝固
20、為凝膠。 瓊脂的用量通常在4~10g/L。,(六)有機(jī)附加物: 1、椰子汁: 用量為100~200g/L。 2、香蕉泥: 使用量為150~200g/L。 3、蘋果汁、番茄汁等。,(七)其他成分: 1、活性炭:使用量為0 .2-1%。 2、抗生素:常用青霉素、鏈霉素、慶大霉素等,用量在5~20mg/L。 3、抑制酚類物質(zhì):抗壞血酸. 4、生長(zhǎng)抑制劑: 常用矮壯素、比
21、久(B9)、多效唑(pp333) 、三碘苯甲酸、根皮酚等.,二、培養(yǎng)基的類型:1、高鹽濃度培養(yǎng)基:MS、B5、SH等。 適用于多數(shù)營(yíng)養(yǎng)需求量較大的植物。2、低鹽培養(yǎng)基:WPM、 White、 Nitsh等。 適用于木本植物的培養(yǎng)。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,表3 N6培養(yǎng)基的組成和配方,三、培養(yǎng)基母液及激素母液的配制: 由于培養(yǎng)基中元素用量少,種類多,因此每次稱量繁瑣,因此通常將各種營(yíng)
22、養(yǎng)成分配制成母液保存。 大量元素 微量元素 有機(jī)營(yíng)養(yǎng) 激素,1、器皿和用具的準(zhǔn)備 儀器包括萬分之一天平,百分之一天平,pH計(jì) 用品包括不同型號(hào)的燒杯(2000ml、1000ml、100ml),容量瓶(1000ml、500ml、100ml)、移液管(10ml、5ml、2ml、1ml)、試劑瓶若干(1000ml、250ml)、移液器(1000ul、200ul)、滴
23、管、玻璃棒、試管、各種規(guī)格三角瓶(150ml、100ml、50ml)、培養(yǎng)基分裝器,漏斗、稱量紙、標(biāo)簽紙、不同范圍pH試紙、鉛筆等。 玻璃器皿用前清洗干凈。,2、藥品及蒸餾水準(zhǔn)備: 藥品采用分析純或化學(xué)純?cè)噭?水利用蒸餾水或去離子水。,3、母液配制: (1)配制母液原則:,相同類型的試劑混合;易形成沉淀的藥品分開;母液濃度要適宜;用量要認(rèn)真計(jì)算和核對(duì); 藥品要準(zhǔn)確稱量。,(2)MS培養(yǎng)基母液的配制:
24、 MS培養(yǎng)基母液根據(jù)試劑特性通常配成四種母液,即大量元素母液(10或20倍)、微量元素母液(100或1000倍)、Fe鹽(100倍)、有機(jī)物(100倍)。 配置前先進(jìn)行根據(jù)培養(yǎng)基組成和配制體積計(jì)算母液試劑用量,然后稱取藥品,大量元素可以用百分之一或千分之一天平,微量元素,鐵鹽和有機(jī)物用萬分之一天平稱量。,(3)激素母液的配制: 根據(jù)各種激素的使用濃度配制適宜的母液,用萬分之一天平稱取激素,溶劑溶解后加水定容。
25、 生長(zhǎng)素類、赤霉素類及脫落酸等用95%乙醇溶解;細(xì)胞分裂素類用1N HCl或1N NaOH溶解。 通常激素母液濃度生長(zhǎng)素類為0.1~0.5 mg/ml, 細(xì)胞分裂素母液濃度為0.2~1.0 mg/ml.,四、培養(yǎng)基的配制:,量取母液:營(yíng)養(yǎng)元素和激素。稱量蔗糖、瓊脂,放入600ml左右蒸餾水的鍋內(nèi),電路上加熱,使瓊脂溶化。加入母液,混合均勻,調(diào)整pH值。,四、培養(yǎng)基的配制:,量取母液:營(yíng)養(yǎng)元素和激素。稱量蔗糖、
26、瓊脂,放入600ml左右蒸餾水的鍋內(nèi),電路上加熱,使瓊脂溶化。加入母液,混合均勻,調(diào)整pH值。,封口:用4-6層稱量紙或瓶蓋封口,之后滅菌備用。分裝入瓶,每瓶40-50ml。,五、培養(yǎng)基的滅菌(高壓蒸汽滅菌):1、加熱: 滅菌前檢查滅菌鍋內(nèi)水量是否充足,然后將培養(yǎng)基放于滅菌鍋內(nèi),改好蓋,關(guān)閉放氣閥,打開電源,加熱升溫。2、排氣: 當(dāng)溫度升至0.5kg/cm(100 0C)時(shí),打開放氣閥徹底排出鍋內(nèi)冷空氣。然
27、后關(guān)閉放氣閥,促使壓力繼續(xù)上升。,3、溫度控制: 當(dāng)鍋內(nèi)壓力升至1.1kg/cm2(121oC)時(shí),計(jì)時(shí)15-20分鐘,計(jì)時(shí)結(jié)束后,關(guān)閉電源。4、出鍋: 當(dāng)滅菌鍋?zhàn)匀焕鋮s后,取出培養(yǎng)基,放置于接種室備用。,1、先天下之憂而憂;后天下之樂而樂?!吨傺汀 ?、捐軀赴國(guó)難,視死忽如歸。——曹植 3、近鄉(xiāng)情更切,不敢問來人。——宋之問 4、氣蒸云夢(mèng)澤;波撼岳陽城?!虾迫弧 ?、中夜四五嘆,常為大國(guó)憂
28、?!畎住 ?、國(guó)恥未雪,何由成名?——李白 7、當(dāng)須徇忠義,身死報(bào)國(guó)恩?!钕V佟 ?、科學(xué)雖沒有國(guó)界,但是學(xué)者卻有他自己的國(guó)家?!退沟隆 ?、虛榮的人注視著自己的名字,光榮的人注視著祖國(guó)的事業(yè)。——馬蒂 10、愛國(guó)主義就是千百年來固定下來的對(duì)自己的祖國(guó)的一種最深厚的感情?!袑帯 ?1、利于國(guó)者愛之,害于國(guó)者惡之?!虌搿 ?2、常思奮不顧身,而殉國(guó)家之急?!抉R遷 13、愛國(guó)如饑渴?!喙獭?/p>
29、 14、一身報(bào)國(guó)有萬死,雙鬢向人無再青。——陸游 15、死去原知萬事空,但悲不見九州同。王師北定中原日,家祭無忘告乃翁?!懹巍 ?6、人生自古誰無死,留取丹心照汗青?!奶煜椤 ?7、天下興亡,匹夫有責(zé)?!櫻孜洹 ?8、南北驅(qū)馳報(bào)主情,江花邊草笑平生。一年三百六十日,都是橫戈馬上行?!堇^光 19、瞞人之事弗為,害人之心弗存,有益國(guó)家之事雖死弗避。——呂坤 20、各出所學(xué),各盡所知,使國(guó)家富強(qiáng)不受外侮,足以
30、自立于地球之上?!蔡煊印 ?1、做人最大的事情是什么呢?就是要知道怎樣愛國(guó)?!獙O中山 22、我們愛我們的民族,這是我們自信心的泉源?!芏鱽怼 ?3、為中華之崛起而讀書?!芏鱽怼 ?4、以身許國(guó),何事不敢為?——岳飛 25、夜視太白收光芒,報(bào)國(guó)欲死無戰(zhàn)場(chǎng)!——陸游 26、位卑不敢忘憂國(guó)?!懹巍 ?7、寄意寒星荃不察,我以我血薦軒轅?!斞浮 ?8、中國(guó)自古以來,就有埋頭苦干的人,就有拼命硬干的人,
31、就有為民請(qǐng)命的人,就有舍身求法的人?!麄兪侵袊?guó)的脊梁?!斞浮 ?9、惟有民魂是值得寶貴的,惟有它發(fā)揚(yáng)起來,中國(guó)人才有真進(jìn)步。——魯迅 30、我們中華民族有同自己的敵人血戰(zhàn)到底的氣概,有在自力更生的基礎(chǔ)上光復(fù)舊物的決心,有自立于世界民族之林的能力?!珴蓶| 31、與其忍辱生,毋寧報(bào)國(guó)死?!蜗隳 ?2、錦繡河山收拾好,萬民盡作主人翁?!斓?3、人民不僅有權(quán)愛國(guó),而且愛國(guó)是個(gè)義務(wù),是一種光榮。——徐特立
32、34、愛國(guó)的主要方法,就是要愛自己所從事的事業(yè)?!x覺哉 35、中國(guó)是古老的民族,也是勇敢的民族。中華民族有兩大優(yōu)點(diǎn):勇敢,勤勞。這樣的民族多么可愛,我們愛我們民族(當(dāng)然其他民族也有他們可愛之處,我們決不忽視這一點(diǎn)),這是我們自信心的泉源?!芏鱽怼 ?6、真正的愛國(guó)者是愛人類的,愛國(guó)決不是排外?!R鐵丁 37、愛國(guó)主義就是千百年來鞏固起來的對(duì)自己的祖國(guó)的一種最深厚的感情?!袑帯 ?8、必須經(jīng)過祖國(guó)這一層樓,然后更
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