第二講 糖分析方法

1、1第二講第二講糖的分析方法糖的分析方法一、中性糖的測定一、中性糖的測定1還原糖的次亞碘酸鹽定量法還原糖的次亞碘酸鹽定量法適用：各種醛糖；適用于測定淀粉酶解時糖苷鍵水解的百分率，也可測定淀粉酶產(chǎn)物的寡聚糖鏈長?；痉磻篊H2OH(CHOH)nCHOI23NaOH→CH2OH(CHOH)nCOONa2NaI2H2O(氧化)I22Na2S2O3→Na2S4O6NaI(滴定)235二硝基水楊酸（二硝基水楊酸（DNS）比色法）比色法原理：在堿性

2、溶液中，35二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應液的顏色強度呈比例關系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。注意：該法不是化學計量反應，戊糖、已糖和雙糖與DNS反應的生色度A500μmol糖的值分別是：戊糖（木糖、阿拉伯糖）：0.42；已糖（葡萄糖、半乳糖、甘露糖）：0.46；雙糖（麥芽糖、乳糖）：0.65。有人認為還原糖的醛基被氧化為羧基，但當量不準確，不同的糖類產(chǎn)生不等等量的色度，表明它的化學

3、反應是較復雜的。3SomogyiNelson法還原糖將銅試劑還原成氧化亞銅，在濃硫酸存在下與砷鉬酸生成藍色溶液，在560nm下的光密度與還原糖濃度呈比例關系。注意：比方法重復性較好，產(chǎn)物穩(wěn)定，測定范圍10180μgmL。4苯酚苯酚硫酸法硫酸法苯酚硫酸試劑可與游離的或寡糖、多糖中的已糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）起顯色反應，已糖在490nm處，戊糖及糖醛酸在480nm處有最大吸收，吸收值與糖含量呈線性關系。注意：（1）該法顏色持久，較穩(wěn)定；（

4、2）每種糖的顯色值不同，故不宜直接用于雜多糖的定量測定；分析雜多糖時，可根據(jù)各種單糖的組成比及主要組分單糖的標準曲線的校正系數(shù)加以校正計算。（3）有顏色的樣品，測定值偏高；（4）此法較適于檢測凝膠柱部分收集樣品中相對糖量的分析。5蒽酮蒽酮硫酸法硫酸法糖類遇濃硫酸脫水生成糠醛或其衍生物，可與蒽酮試劑縮合產(chǎn)生顏色物質(zhì)，反應后溶液呈藍綠色，于620nm處有最大吸收，顯色與多糖含量呈線性關系。注意：該法可用于多糖、單糖含量測定。色氨酸含量較高的

5、蛋白質(zhì)對顯色反應有一定干擾。6地衣酚地衣酚硫酸法硫酸法3糖分析柱，包括氨基柱和鈣離子柱。11紙色譜法和薄層色譜法測定紙色譜法和薄層色譜法測定該法既可用作定性測定，也可作為半定量分析方法。該法既可分析單糖，又可分析低聚糖。半定量分析可通過薄層掃描進行。12糖的氣相色譜分析糖的氣相色譜分析糖的氣相色譜分析一般只用于單糖的定性和定量測定。由于糖類無特征吸收，故采用氣相色譜法檢測進，先要對糖進行衍生化。常的衍生化方法包括：三甲基硅醚衍生化、糖腈

6、乙酸脂衍生化、糖醇乙酸脂衍生化、三氟乙酸脂衍生化。13多糖的電泳分析法多糖的電泳分析法電泳技術是指以電場為驅(qū)動力的一類分離分析手段。它依據(jù)樣品于一定分離介質(zhì)中在電場E作用下所表現(xiàn)出來的速度V及其差異來分離。用于多糖分析的電泳包括：濾紙電泳、玻璃纖維低電泳、醋酸纖維薄膜電泳、凝膠電泳、高效毛細管電泳、等電聚焦電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。二、氨基已糖的測定二、氨基已糖的測定1氨基已糖的比色測定氨基已糖的比色測定存在于蛋白聚糖（或糖胺聚糖）及

7、糖蛋白中的N取代（乙酰基或硫酸基）氨基已糖可通過鹽酸水解成游離氨基已糖（氨基葡萄糖和氨基半乳糖）釋出。氨基已糖經(jīng)堿性乙酰化反應后能與對二甲氨基苯甲醛（PDABA）呈色而進行定量。又由于兩種氨基已糖在100和25℃下乙酰化程度不同，可進一步對它們作出鑒別定量。注意：（1）當用此法測定糖蛋白樣品中的氨基已糖時，最好將樣品的水解液先通過強酸型陽離子樹脂，經(jīng)脫酸后，再測定。（2）糖胺聚糖中，肝素采用本法測定氨基葡萄糖含量偏低。提高水解溫度或延長

8、水解時間均不能改善結(jié)果。2N乙酰氨基已糖的比色測定乙酰氨基已糖的比色測定存在于糖蛋白和蛋白聚糖（糖胺聚糖）中的N乙酰氨基已糖經(jīng)各種N乙酰氨基已糖糖苷本科和糖胺聚糖裂解酶作用出的N乙酰氨基已糖可利用MganElson反應進行比色測定。注意：（1）本法適用于游離或位于寡糖鏈還原性端基的N乙酰氨基已糖的定量分析。（2）N乙酰氨基半乳糖在本比色反應條件下的吸收度僅為N乙酰氨基葡萄糖的35%，因此制備標準曲線所用的標準糖應視所測樣品中的N乙酰氨基