全內(nèi)反射熒光成像基本原理

1、全內(nèi)反射熒光成像基本原理 Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF),全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM),目前用于單分子研究的檢測(cè)技術(shù)主要有兩大類(lèi)：掃描探針顯微技術(shù)（SPM）和光學(xué)技術(shù)。其中：,SPM,,原子力顯微技術(shù)（AFM）,掃描離子電導(dǎo)顯微技術(shù)（ SICM）,掃描隧道顯微技術(shù)（ STM）,上世紀(jì)80 年代，Axelrod 等生物物理學(xué)家對(duì) TIRFM 技術(shù)及基本原理進(jìn)行描述，并探索了

2、其在生物方面的應(yīng)用。,發(fā)展歷程,Axelrod,Julius,阿克塞爾羅德（Axelrod,Julius) 美國(guó)生物化學(xué)家及藥理學(xué)家。 1970年他與卡茨馮奧伊勒共享了諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。于美國(guó)衛(wèi)生研究院度過(guò)其大部職業(yè)生涯。他研究藥物及激素的作用、神經(jīng)沖動(dòng)傳播的化學(xué)方面，并特別研究松果體的功能。,光反射和折射示意圖,全內(nèi)反射示意圖,光的反射和折射,Snell定律：,當(dāng)入射角不斷增大，透射角為增大 90°時(shí)，入射角達(dá)到臨界角

3、θc。依據(jù) Snell 定律得出：,當(dāng)入射角繼續(xù)增大時(shí)，光不再透射進(jìn)水溶液，即發(fā)生了全內(nèi)反射。,實(shí)際上，由于光的波動(dòng)效應(yīng)，有一部分光的能量會(huì)透過(guò)臨界面滲透到水溶液中，平行于界面向水溶液中傳播，這一部分透過(guò)的能量場(chǎng)則稱之為“隱失波” 或“隱失場(chǎng)”。,隱失波,隱失波,隱失波的頻率與入射光線的頻率相同，其強(qiáng)度隨臨界面的垂直距離呈指數(shù)衰減：,其中：Z是離開(kāi)分界面的距離，I(z)表示距離界面Z處的強(qiáng)度；I(0)表示臨界面處的強(qiáng)度。,由于隱失波僅在

4、界面上極薄的一層范圍內(nèi)傳播，所以利用隱失波照明樣品，可以僅激發(fā)厚度大約 100nm 內(nèi)的熒光團(tuán)，而更深層溶液中的熒光基團(tuán)不會(huì)被激發(fā)，因此極大地提高了顯微成像的對(duì)比度和信噪比。,d12是滲透深度，它等于從分界面處到光強(qiáng)衰減 l/e 處的距離。,隱失波的滲透深度d12是入射角及相對(duì)折射率的函數(shù)。 d12是滲透深度,它等于從分界面處到光強(qiáng)衰減到分界面處數(shù)值l/ e的處的距離。對(duì)于可見(jiàn)光波長(zhǎng)而言，浸透深度約為100

5、nm。,隱失波強(qiáng)度成指數(shù)衰減曲線,隱失波存在的實(shí)驗(yàn)證明,兩塊光密媒質(zhì)做的棱鏡中間夾一薄層空氣層(光疏媒質(zhì))。 如果不斷減少空氣層的厚度,由于空氣層中有透射波,這透射波進(jìn)人第二塊棱鏡。,光學(xué)隧道效應(yīng),光強(qiáng)度并不發(fā)生全反射,而是有隱失波存于介質(zhì)2中。當(dāng)光疏介質(zhì)薄膜的厚度小于隱失波的滲透深度時(shí),這個(gè)波不僅穿過(guò)了光疏介質(zhì),而且會(huì)促進(jìn)鄰近高折射率介質(zhì)3中的電子作受迫振動(dòng),由此產(chǎn)生了新的次波,隱失波的形態(tài)發(fā)生了顯著改變,全反射被破壞,能量發(fā)生了流動(dòng)

6、,導(dǎo)致了光學(xué)隧道效應(yīng)的產(chǎn)生。,全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)，是利用光發(fā)生全內(nèi)反射時(shí)產(chǎn)生的隱失波照明樣本，僅激發(fā)樣本表面薄層范圍內(nèi)的熒光基團(tuán)。,與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡相比，使顯微成像在Z軸上的空間分辨率得到了顯著改善，大大提高了圖像的信噪比和對(duì)比度。,全內(nèi)反射熒光顯微成像系統(tǒng),分子熒光的產(chǎn)生,當(dāng)一束特定波長(zhǎng)的光照射到物質(zhì)時(shí)，物質(zhì)分子與光量子發(fā)生“碰撞”。如果這次碰撞時(shí)有效的：,激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑發(fā)生的幾率大。熒光：10-7-10-9

7、s磷光：10-4-100s,分子熒光的產(chǎn)生,電子躍遷的單重態(tài)（單線態(tài)）與三重態(tài)（三線態(tài)）,在光致激發(fā)和去激發(fā)光的過(guò)程中，分子中的價(jià)電子（n, π）處于不同的自旋狀態(tài)，通常用多重態(tài)M來(lái)描述： M＝2S＋1＝1 電子自旋的大小用自旋量子數(shù)S表示，S可為+1/2或－1/2，這里的正負(fù)號(hào)取決于自旋的方向?；鶓B(tài)中每個(gè)能級(jí)通常被兩個(gè)自旋相反的即自旋配對(duì)的電子占據(jù)，M=1，成為單重態(tài)。,當(dāng)成對(duì)電子中的一個(gè)

8、被激發(fā)到S1、S2等電子能級(jí)激發(fā)態(tài)時(shí)，其自旋不變，即仍和處于基態(tài)的另一電子成對(duì)。這些能態(tài)都被稱為單線態(tài)或單重態(tài)(singlet state)。 但如果處于第一電子激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的電子通過(guò)無(wú)輻射躍遷（系間跨越，intersystem crossing)改變自旋方向，則因消耗部分能量而降至另一種激發(fā)態(tài)：S＝1/2＋1/2＝1，多重度 M＝2S＋1＝2?1＋1＝3，這種電子激發(fā)態(tài)稱為三重態(tài)(triplet state)。,分子熒光

9、的產(chǎn)生（雅布隆斯基分子能級(jí)圖）,熒光發(fā)射：電子由第一激單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)到基態(tài)，多為S1-S0。由于基態(tài)中也有振動(dòng)弛豫躍遷，這使得發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量要小，所以，熒光的特征波長(zhǎng)比入射波長(zhǎng)要長(zhǎng)。 熒光是相同多重態(tài)間的允許躍遷，產(chǎn)生速度快：10-9—10-7s，又叫快速熒光或瞬時(shí)熒光。外部光源停止照射，熒光馬上會(huì)消失。 磷光發(fā)射：第一激發(fā)三重最低振動(dòng)能級(jí)到基態(tài)（10-4—10s），外部光源

10、停止照射后，可以持續(xù)一段時(shí)間。,分子熒光的產(chǎn)生,目前，大多數(shù)全內(nèi)反射熒光顯微鏡主要有兩種基本類(lèi)型：棱鏡型和物鏡型(或無(wú)棱鏡型)。,棱鏡型,全內(nèi)反射熒光顯微鏡結(jié)構(gòu),全內(nèi)反射熒光顯微鏡結(jié)構(gòu),物鏡型使用高數(shù)值孔徑(NA≥1．4)的物鏡作為熒光信號(hào)的接受器，同時(shí)又作為發(fā)生全內(nèi)反射的光學(xué)器件，樣品的放置非常方便，并且可與多種技術(shù)聯(lián)用，例如納米操縱、光鑷技術(shù)、原子力顯微鏡等。,該系統(tǒng)的關(guān)鍵是高數(shù)值孔徑物鏡的使用。由于細(xì)胞的典型折射率為1．33～1．