2017神經(jīng)解剖學研究方法

1、神經(jīng)生物學——研究技術(shù)與方法,周麗華,教授, Ph.D M.D中山大學中山醫(yī)學院人體解剖教研室zhoulih@mail.sysu.edu.cn,What is Neuroscience?,The study of the nervous system including the brain, the spinal cord, and networks of neurons, advances the understanding o

2、f human thought, emotion, and behavior.Humans contain roughly 100 billion neurons, which communicate with each other by sending electrical signals long distances and then releasing neurotransmitters which cross synapses

3、.,Neuroscience — a recognized discipline characterized by:,A unified field that integrates biology, chemistry, and physics with studies of structure, physiology, and behavior, including human emotional and cognitive func

4、tions.Neuroscientists come from many different disciplines including psychology, zoology, physics, anthropology, biology, chemistry, physiology, and philosophy. A diverse educational background will provide the most imp

5、ortant skill of all: how to ask questions.,Neuroscience Researchers?,Molecular biologists isolate and describe the genes that produce the proteins important to neuron function.Neuroanatomists study the structure and org

6、anization of the nervous system. Developmental neuroscientists study how the brain grows and changes. They define chemicals and processes neurons use to seek out and connect with other neurons and maintain connections.

7、Cognitive neuroscientists study functions such as perception and memory in animals by using behavioral methods and other neuroscience techniques. In humans, they use non-invasive brain scans -- such as positron emission

8、tomography and magnetic resonance imaging -- to uncover routes of neural processing that occur during language, problem solving and other tasks.,Neuroscience Research?,Behavioral neuroscientists study the processes under

9、lying behavior in humans and in animals. Their tools include microelectrodes and brain scans.Advanced computer systems are enabling neuroscientists to devise models of neurons and their connections in the brain -- how h

10、umans perform complex tasks. Clinical neuroscientists — psychiatrists, neurologists and other medical specialists — use basic research findings to develop diagnostic methods and ways to prevent and treat neurological di

11、sorders that affect millions of people.,Neuroscientists work to:,Describe the human brain and how it functions normally. (現(xiàn)象)Determine how the nervous system develops, matures and maintains itself through life （本質(zhì)）. Fi

12、nd ways to prevent or cure many devastating neurological and psychiatric disorders （干預(yù)）.,Challenges for the Future （in 2005）,What are the methods for early detection of neurological disorders such as Parkinson's dise

13、ase and Alzheimer's disease and for mental disorders such as schizophrenia and depression? What are the causes of these illnesses? What are the cures?How can we help nerves regenerate? Can we cure spinal cord injuri

14、es? Can we transplant or replace parts of the brain?What causes chronic pain? What is the best way to treat pain? How can we tap into our endogenous pain inhibitory system? What are the mechanisms of addiction? Are the

15、re better ways to treat addictions?How are memories formed, stored and lost?What are better ways to image the living brain?,Challenges for the Future,What is the neurological basis of emotions such as anger, happiness

16、and sadness?What are the differences in the brains of men and women and what do these differences mean?How does experience and learning affect the brain and how can we use this information to improve our daily lives?

17、What are the neurological mechanisms of "alternative medicine" treatments such as acupuncture, herbal therapy and hypnosis and how can these methods be used to treat nervous system disorders?Why do we sleep

18、 and how can we shift our internal body clocks?What is consciousness?,21世紀神經(jīng)生物學可望取得突破性進展的5個新領(lǐng)域,,腦動態(tài)神經(jīng)元功能成像研究,如果能動態(tài)顯示在不同腦功能狀態(tài)下每個神經(jīng)元的興奮過程，相當于將腦功能成像與無創(chuàng)性單神經(jīng)元記錄相結(jié)合，則對人腦功能活動的認識將更加深入。目前腦的功能成像的空間分辨率為毫米級，時間分辨率為秒級，遠遠不能滿足腦功能研究的需

19、要。神經(jīng)元胞體的大小約為20一40微米 如果CT的空間分辨率再提高至l0微米的近微米數(shù)量級，就可以“看見”單個的神經(jīng)元。目前工業(yè)CT已能達到10微米的分辨率。由于采用電子束掃描技術(shù)代替機械掃描，在時間分辨率方面已由每幀1OO秒提高到50ms/幀．達到近毫秒級水平。如果醫(yī)學CT能采用工業(yè)CT的一系列先進技術(shù)．如CCD集成電路檢測技術(shù)，雙能電子束掃描技術(shù)等，有可能將空間和時間分辯率再提高一個數(shù)量級．達到微米和的ms/幀水平（動態(tài)顯微CT)

20、。,已經(jīng)知道，胞外鈣離子濃度為10-4mo1/L 而胞內(nèi)鈣離子濃度為10-2 mol／L，二者相差100倍，當神經(jīng)元興奮時，鈣離子通道開放，胞內(nèi)鈣在短暫的數(shù)百微秒之內(nèi)可增高達1000倍左右，但由于鈣泵前作用．胞內(nèi)鈣離子濃度很快即恢復至正常水平。 所以用動態(tài)的(ms/幀)和顯微(微米)CT，再結(jié)臺雙能x線束來檢測胞內(nèi)鈣離子濃度的瞬態(tài)上升．就可以觀測腦在不同功能狀態(tài)下單個神經(jīng)元的興奮過程 這樣即可以研究在不同外界輸入狀態(tài)下腦內(nèi)神經(jīng)元活動的內(nèi)

21、在模式，以及在思考、記憶、學習時神經(jīng)元活動的動態(tài)時空編碼．由此提供的大量數(shù)據(jù)．再用電子計算機進行分析處理．將對腦功能的研究更加深人。,,,神經(jīng)系統(tǒng)多基因病的定位及老年性癡呆發(fā)病機理的闡明,隨著人口的老齡化．老年性癡呆的發(fā)病率逐年上升，老年性癡呆已成為21世紀的社會問題。已經(jīng)知道，老年癡呆是一個多基因的疾病．其發(fā)病機理至今尚未徹底明了一預(yù)期在21世紀．這一問題將最終得到解決。,神經(jīng)系統(tǒng)信息的編碼研究,20世紀Adrian研究各種刺激對感受

22、器及單根神經(jīng)纖維放電的影響，發(fā)現(xiàn)脈沖放電頻率的對數(shù)與刺激量成正比．Freeman在嗅球研究嗅覺的混沌吸引子編碼，Singh在視覺皮層發(fā)現(xiàn)40赫茲的同步放電等。 神經(jīng)系統(tǒng)信息編碼可分為快速的神經(jīng)元狀態(tài)編碼和緩慢的突觸聯(lián)系強度編碼兩大類。神經(jīng)元的興奮與靜息兩種基本狀態(tài)?？煞謩e以1和0加以編碼，具有N個神經(jīng)元的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)共有N種不同狀態(tài)，組成N維編碼空間。不同的外界輸人．組成在N維狀態(tài)空間中的一組編碼鏈。神經(jīng)元狀態(tài)編碼方式?jīng)Q定外界輸人在腦內(nèi)

23、的內(nèi)部映象。與腦內(nèi)信息的傳輸與加工關(guān)系密切。而突觸聯(lián)系強度編碼是可塑的。包括新的突觸形成與原有突觸聯(lián)結(jié)消失，以及原有突觸聯(lián)系強度的增強與消退等兩個過程。突觸聯(lián)系強度編碼是連續(xù)的、分域的，它和腦的學習與信息存儲功能密切相關(guān)。,后基因組時代的神經(jīng)生物學,后基因組時代有兩個主要的研究方向： 一是從基因結(jié)構(gòu)與定位轉(zhuǎn)向?qū)虻墓δ芗捌湔{(diào)控機理的研究； 二是研究各種生物活性蛋白分子的空間構(gòu)象與其生物學功能的關(guān)

24、系。 分子神經(jīng)生物學將從后基因組分子生物學中得到啟發(fā)和促進．進一步對神經(jīng)系統(tǒng)的生長、發(fā)育 再生、凋亡、學習、記憶、思維、注意等腦功能基因的調(diào)控規(guī)律及相關(guān)的蛋白質(zhì)活性分子的空間構(gòu)象及功能進行系列的研究,意識、思維、情緒本質(zhì)的探討,意識、思維和情緒的功能活動固然是建立在腦區(qū)、神經(jīng)元和分子活動水平的基礎(chǔ)之上，但更主要的是用系統(tǒng)論的方法，把腦的各個層次的功能活動整合起來加以研究，才能最終解決意識，思維與情緒活動之謎。在21世紀，這方面可

25、能繼續(xù)取得更大的進展。,2016年Science雜志評選“人類突破了十大前沿科技”,腦和認知方面，腦圖譜繪制、認知計算、腦控等技術(shù)取得實質(zhì)性進展，為人類認知能力的增強，以及腦科學的軍事應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。1. 美國艾倫腦科學研究院繪出了迄今最完整的數(shù)字版人腦結(jié)構(gòu)圖譜，也是迄今最清晰腦部微觀解剖學結(jié)構(gòu)圖譜，將成為大腦研究人員的最新指南和“導航圖”，標志著在理解人腦方面的巨大飛躍；2. 美國加州大學伯克利分校繪制出人類大腦中語義信息功

26、能呈現(xiàn)的圖譜，可揭示語言的神經(jīng)生物學機理；3. 美國華盛頓大學的研究小組繪制出迄今最全面、最精確的人類大腦圖譜，其中97個人類大腦皮層區(qū)域?qū)儆谑状喂肌?. 美國國家衛(wèi)生研究院的研究項目團隊開發(fā)出一種新的神經(jīng)成像技術(shù)，可看到人腦中基因開關(guān)的位置，為了解影響精神健康的基因提供了有力工具。,5. DARPA首次成功在動物受試者上測試了一種通過血管進入腦部，記錄神經(jīng)活動的微型傳感器。6. 美國勞倫斯利弗莫爾國家實驗室和IBM公司聯(lián)合公布

27、了以“真北”仿腦處理器芯片為基礎(chǔ)的具有認知能力的深度學習超級計算機，標志著人類進入認知計算的新時代，深度學習超級計算機對于網(wǎng)絡(luò)安全、核武器模擬等具有重大意義。 7. 韓國科學家在一塊10厘米的晶圓上，構(gòu)建了144個突觸晶體管，研制出迄今為止能耗最低的人造突觸，這一突破有望使研制大型類腦計算機成為現(xiàn)實。8. 美國科學家研制出了一種新型“擴散式憶阻器”，能逼真地模擬人腦突觸內(nèi)鈣離子的行為，新設(shè)備有助于開發(fā)類腦（神經(jīng)形態(tài)）計算機。,201

28、6年Science雜志評選“人類突破了十大前沿科技”,相關(guān)網(wǎng)絡(luò)信息,神經(jīng)科學研究的國內(nèi)外組織神經(jīng)科學相關(guān)的科學期刊神經(jīng)科學相關(guān)的著名的國際研究機構(gòu),神經(jīng)解剖學和神經(jīng)生物學的研究方法,,一、 神經(jīng)結(jié)構(gòu)的經(jīng)典研究方法,1. 大體解剖的研究方法 固定和非固定腦和脊髓的移取和保存——觀察外部形態(tài),一、 神經(jīng)結(jié)構(gòu)的經(jīng)典研究方法,1. 大體解剖的研究方法腦膜和腦血管標本的制作，腦血管的顯示：固定——頸內(nèi)動脈灌注紅色充填劑——浸泡——70%甘

29、油透明顯示,一、 神經(jīng)結(jié)構(gòu)的經(jīng)典研究方法,1. 大體解剖的研究方法腦的解剖剝離標本：顯示腦白質(zhì)和基底核,24,2. 腦厚片（0.5-1.0cm）染色技術(shù) 利用腦灰質(zhì)和白質(zhì)所含髓磷脂的量不同，用水溶劑染料使灰質(zhì)著色，用脂溶性染料使白質(zhì)著色的方法。,一、 神經(jīng)結(jié)構(gòu)的經(jīng)典研究方法,25,3. 腦和脊髓的常用切面——正中矢狀切面，水平切面,一、 神經(jīng)結(jié)構(gòu)的經(jīng)典研究方法,3. 腦和脊髓的常用切面——冠狀切面,大白鼠實驗頭位,按照不同的定位

30、圖進行大白鼠腦實驗時, 必須采取和定位圖相應(yīng)的頭位。大白鼠的實驗頭位有多種（在定位儀上）：用耳桿固定大白鼠的外耳道后, 調(diào)節(jié)切牙棒的高度使前囟高于人字縫尖1毫米。調(diào)節(jié)切牙棒使其上緣高于耳間線5毫米·調(diào)節(jié)切牙棒使耳間線中點至切牙棒前上緣的垂線與儀器水平面成5度的交角確定大白鼠的實驗頭位是依據(jù)腦的冠狀平面應(yīng)與神經(jīng)軸相垂直。中腦與間腦的分界面通過后連合后緣和腳間窩前緣, 大體上垂直于神經(jīng)軸, 把它作為鼠腦的冠狀基平面圖, 當

31、此平面與水平面垂直時,鼠頭的位置即是規(guī)定的實驗頭位。 對體重為150克雌鼠的實驗頭一位進行了測定, 測出耳間線比切牙棒上緣高2.4毫米, 耳間線中點到切牙棒前上緣的垂線與水平面成5度的交角。,腦立體定位儀,Caudate nucleus,Putamen,Globus pallidus,3. 組織學的研究方法,光學顯微鏡——顯微結(jié)構(gòu)（微米μm） 普通，倒置，相差，暗視野，熒光，偏關(guān)電子顯微鏡——超微結(jié)構(gòu)（納米nm和埃A

32、） 掃描，透射，共聚焦，雙光子活體成像顯微技術(shù)，等等,組織學的研究方法,固定組織的標本制作方法 固定和固定液：甲醛、戊二醛，等 涂片和切片： 石蠟（5-10μm ） 冰凍（15-40μm ） 恒冷箱（5-25μm ）,冷凍干燥真空包埋 振動（30-100μm ） 超?。╪m ） 染色、顯色和拍照：細胞成分與酸性或者堿

33、性染料的理化反應(yīng)。,Hematoxylin-Eosin （HE）stain,蘇木精（H）：陽離子染料，將細胞核內(nèi)的是堿性物質(zhì)染成藍色伊紅（E）：陰離子染料，將細胞質(zhì)和膠原原纖維染成粉紅色,4. 神經(jīng)解剖學的傳統(tǒng)染色方法,（2）Golgi（銀浸染）法(Golgi stain),能在大量神經(jīng)細胞中鍍?nèi)境錾贁?shù)神經(jīng)元的全貌。,十九、二十世紀神經(jīng)系統(tǒng)構(gòu)造的網(wǎng)狀學說,,（3）Cajal stain,顯示神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)原纖維neurofibri

34、llary及軸突末梢,神經(jīng)元學說,神經(jīng)細胞是一個獨立的生物學單位（神經(jīng)元），神經(jīng)元間的聯(lián)系不是通過細胞的連續(xù)，而是通過彼此的接觸來完成的。并描述了神經(jīng)元的樹突及軸突，提出樹突是接受區(qū)，神經(jīng)元極性的概念。,Electron microscope (1950s)：TEM，SEM,證實神經(jīng)元學說的證據(jù),（4）Nissl stain尼氏染色(1892) 染神經(jīng)組織內(nèi)的核酸 RNA and DNA，神經(jīng)元核仁含豐富的RNA和一層DN

35、A外殼，核中染色質(zhì)少。胞漿內(nèi)含大量的RNA，以尼氏體的型式存在，膠質(zhì)細胞核質(zhì)深染但胞漿內(nèi)無尼氏體。,（5）Weigert 法(1884)：染髓鞘，而不能用于研究薄髓和無髓纖維（6）Luxol堅牢藍：屬于銅-酞菁染料，在酒精溶液內(nèi)具有與髓鞘磷脂結(jié)合的染色特性。,（7）Marchi (1890): 用四氧化鋨染變性的髓鞘（8）Nauta法: 將變性神經(jīng)原纖維染成黑色，抑制正常神經(jīng)元纖維的著色（順行追蹤法）,年齡及病理變化,二、近代追蹤

36、神經(jīng)通路的研究方法,辣根過氧化物酶法（Horseradish perosidase HRP method） 運輸速度：逆行50-80mm/d， 順行50-500mm/d,,神經(jīng)元的胞漿轉(zhuǎn)運 axonal transplant,神經(jīng)元胞體中合成的結(jié)構(gòu)和功能物質(zhì)以及有形成分在胞體和外周突起之間，或神經(jīng)元與周圍微環(huán)境之間的往返轉(zhuǎn)運。維持神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)，為神經(jīng)的生長發(fā)育、新陳代謝提

37、供物質(zhì)基礎(chǔ)；作為神經(jīng)系統(tǒng)中分子信息傳遞的重要部分，與神經(jīng)沖動的電信息相互整和，實現(xiàn)對神經(jīng)元的調(diào)控.分類： 順行軸漿快轉(zhuǎn)運：小泡、線粒體、SER 順行軸漿慢轉(zhuǎn)運：骨架蛋白 0.2~8mm/d 逆行軸漿轉(zhuǎn)運：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)體、大致密芯泡,二、近代追蹤神經(jīng)通路的研究方法,放射自顯影神經(jīng)順行追蹤2-脫氧葡萄糖（2-DG），神經(jīng)組織局部代謝PHA-L順行軸突追蹤法生物胞素和神經(jīng)生物素生物素化葡聚糖

38、（Biotinylated Dextran amine, BDA）霍亂毒素熒光色素標記神經(jīng)束路化學損毀免疫電鏡酶或者分子標記結(jié)合影像技術(shù)（CT, MRI, PET）,熒光追蹤劑及其追蹤法,逆行或雙向追蹤法,HRP 植物凝集素（PHA）毒素(CT,HSC PrV) 生物素或生物素化的葡聚糖（BDA）熒光色素單標，雙標，等2-DG法,Patch and FITC,,Confocal electron microscope

39、(1993) neuron structures alive,化學損傷技術(shù),軸突切斷單胺能和膽堿能毒劑,腦功能成像技術(shù),1973年，Hounsfield用電子計算機斷層成像技術(shù)首次在活體條件下現(xiàn)察到人腦的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。其后MRI，fMRI，PET，SPECT等腦的結(jié)構(gòu)及功能成像技術(shù)得到迅速的發(fā)展。 Phelps建立的PET成像技術(shù)能在正常條件下顯示出人腦在不同功能活動狀態(tài)時腦內(nèi)各種活性物質(zhì)(氧、葡萄糖等)的代謝變化過程，是腦功能定位成像

40、的重大突破它為研究人的心理及智能活動奠定基礎(chǔ).,,,三、化學神經(jīng)解剖學的研究方法,針對神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)、受體和離子通道、信號蛋白的研究方法 1. 所有分子生物學用于檢測基因的研究方法 2. 基于抗原抗體的反應(yīng)的功能蛋白定位檢測方法 流式細胞儀 配體標記法 Western-blotting 免疫組織化學染色法 原位雜交組織化學法 3.基于神經(jīng)遞質(zhì)的酶活性的組

41、織化學反應(yīng)檢測方法,突 觸,1 概念 是神經(jīng)元之間或神經(jīng)元和非神經(jīng)元之間連接的特化結(jié)構(gòu)，有傳遞信息和分析整合的作用。,2 化學突觸的結(jié)構(gòu),突觸間隙：介于突觸前后膜之間；突觸前成分：包括突觸前膨大和突觸前膜， 內(nèi)含突觸小泡和線粒體；突觸后成分：含神經(jīng)遞質(zhì)的受體，其胞質(zhì)面有致密物質(zhì)附著。,免疫細胞化學,免疫熒光細胞化學免疫酶法（PAP）ABC免疫組織化學中的交叉反應(yīng)免疫組織化學染色的對照試驗

42、陽性對照 陰性對照 自身對照 吸收試驗,,,四、光學探針、數(shù)字熒光圖像儀和形態(tài)定量法,鈣的熒光探針乙酰膽堿酯酶組化染色（AChE）單胺的熒光組織化學 (FA)顯微分光光度計顯微熒光光度計圖像分析形態(tài)定量研究方法,五、神經(jīng)組織和神經(jīng)細胞培養(yǎng),Neural cells are not directly derived from ES cells. Mature cel

43、ls of the nervous system come from a variety of cells lineages and progenitors that differentiate into specific cell types. Different lineages are also known to support the differentiation of other cell lineages.,神經(jīng)細胞譜系

44、 lineages形成,基質(zhì)誘導,誘導物質(zhì) 細胞外基質(zhì)：膠原，糖胺多糖和蛋白多糖 誘導組織：actin, noggin, follistain 等 細胞粘著分子 ：CAMs,Zhao, S. et al. Development 2004;131:5117-5125,Co-cultivation of reeler (rl-/-) dentate gyrus with wild type rescue