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1、用遺傳學(xué)與生理學(xué)相結(jié)合的方法研究氨基酸生產(chǎn),2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),2,,,前 言 對(duì)微生物的代謝途徑及代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行有目的的改造從而提高氨基酸的產(chǎn)量仍然是現(xiàn)代生物工程學(xué)的一個(gè)主攻目標(biāo)。為了攻克這個(gè)目標(biāo),就有必要對(duì)尚待進(jìn)一步完善的細(xì)胞生理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)及生物過(guò)程工程等學(xué)科的基本狀況做一番描述,主要有如下幾個(gè)話(huà)題:,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),3,,①與生
2、物工程相關(guān)的氨基酸產(chǎn)生菌的相關(guān)途徑的研究進(jìn)展情況,其中必須包括這些途徑的代謝調(diào)節(jié)以及細(xì)胞的整個(gè)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的研究進(jìn)展情況。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),4,②對(duì)所有的相關(guān)途徑進(jìn)行詳細(xì)的代謝流量分析。這涉及到基質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的碳架物流量,流經(jīng)向心途徑、中心代謝途徑和離心途徑的碳架物流量,以及代謝中間產(chǎn)物流出細(xì)胞的碳架物流量 ( the central and peripheral carbon fluxes)。 還原力
3、的流量 ( redox flux )及能量流量(energy flux)。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),5,,③以協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)的方式對(duì)碳架流、氧化還原反應(yīng)的電子流、能量流進(jìn)行導(dǎo)向,以提高基質(zhì)的吸收能力、限制前體物向支路途徑的流量、減少中間產(chǎn)物的積累及副產(chǎn)物的形成,還要繞過(guò)氧化還原平衡及能量平衡中可能出現(xiàn)的難題。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),6,,傳統(tǒng)的設(shè)計(jì)育種( 隨機(jī)誘變加定向篩選),以及DNA重組技術(shù)
4、在設(shè)計(jì)育種中的應(yīng)用已經(jīng)大大提高了 微生物對(duì)氨基酸的生產(chǎn)能力, 但人們對(duì)于氨基酸產(chǎn)生菌的生理學(xué)與生物化學(xué)等 主要領(lǐng)域的基礎(chǔ)知識(shí)還相當(dāng)匱乏。 目前可從以下幾方面理解氨基酸的代謝基礎(chǔ):,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),7,,①具有生物工程學(xué)重要性的微生物的基本代謝途徑及其對(duì)應(yīng)的酶的性質(zhì);②酶及其調(diào)節(jié)方式,途徑及其調(diào)節(jié)方式;③中心代謝途徑及離心途徑代謝流量的定量分析;④對(duì)跨膜傳送(基質(zhì)吸收和產(chǎn)物分泌)的詳盡
5、的了解。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),8,,目的產(chǎn)物的合成途徑是理解氨基酸生產(chǎn)的前提和核心內(nèi)容 。相關(guān)的代謝途徑不僅包括那些直接導(dǎo)致某特定氨基酸的合成的專(zhuān)用途徑,也包括提供前體碳架物的途徑、從專(zhuān)用途徑分流最終導(dǎo)致副產(chǎn)物生成的分支途徑、相應(yīng)氨基酸自身被降解的途徑、以及那些提供還原力和代謝能量的途徑。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),9,,除了以上這些反映代謝途徑基本信息的資料外,代謝流量的相對(duì)固定的分布以及
6、代謝流量的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)同樣是至關(guān)重要的。這既涉及到中心代謝途徑(提供碳架物質(zhì)、還原力及代謝能)的代謝流的定量分析,又涉及到特定氨基酸專(zhuān)用的合成途徑的代謝流的定量分析。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),10,,此外,基質(zhì)吸收和目的產(chǎn)物輸出等有方向性的跨膜反應(yīng)對(duì)于氨基酸的生產(chǎn)也是極其重要的。除大腸桿菌外,一般工業(yè)微生物基質(zhì)吸收方面的知識(shí)是相當(dāng)欠缺的。氨基酸跨膜輸出的研究領(lǐng)域近年才受到關(guān)注。方向性的跨膜反應(yīng)的機(jī)理、微生物能學(xué)及氨基
7、酸分泌的調(diào)節(jié)等方面的知識(shí)對(duì)于理解氨基酸生產(chǎn)過(guò)程也是相當(dāng)重要的。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),11,,我們將一起回顧發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的代謝基礎(chǔ)的建立過(guò)程,一起討論代謝流量分析對(duì)于了解細(xì)胞生理的意義和氨基酸生物合成的代謝工程,還將一起討論跨膜輸送方面為數(shù)不多的研究工作,以及這方面研究對(duì)于微生物過(guò)量合成氨基酸的意義。在此基礎(chǔ)上,討論以氨基酸為目的產(chǎn)物的微生物代謝設(shè)計(jì)的新進(jìn)展和新方法。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講
8、座),12,,1. 氨基酸生產(chǎn)的代謝基礎(chǔ)2. 氨基酸生物合成的代謝流量 分析3. 基質(zhì)的跨膜吸收與氨基酸的 跨膜輸出4. 氨基酸生產(chǎn)的代謝設(shè)計(jì),2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),13,,,,氨基酸生產(chǎn)的代謝基礎(chǔ)1.1 氨基酸的生物合成1.2 代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的生理學(xué),2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),14,,,1. 1 氨基酸生產(chǎn)的代謝基礎(chǔ) 氨基酸的
9、生物合成涉及以下5個(gè)方面: (1)基質(zhì)吸收;(2)進(jìn)入中心代謝途徑前的準(zhǔn)備途徑;(3)經(jīng)中心代謝途徑產(chǎn)生碳架化合物(氨基酸的前體化合物)、還原力(如NADPH、NADH )和代謝能( ATP 和磷酸烯醇式丙酮酸等);,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),15,,(4)通過(guò)同化( 合成) 途徑將碳架化合物轉(zhuǎn)化成目的氨基酸,此過(guò)程涉及到還原力與代謝能的供需平衡,同時(shí)也涉及主要載流途徑與分支途徑之間的關(guān)系; (5)目的氨基酸
10、的跨膜輸出等;(6)目的產(chǎn)物進(jìn)一步代謝的途徑。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),16,,谷氨酸棒桿菌中賴(lài)氨酸的合成是研究得最為廣泛的。圖 2 列出了谷氨酸棒桿菌中天冬族氨基酸生物合成相關(guān)的途徑及重要步驟的代謝調(diào)節(jié)情況。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),17,圖1. 微生物細(xì)胞合成氨基酸的相關(guān)途徑及代謝調(diào)節(jié)示意圖,,其中,各相關(guān)酶及途徑水平上的代謝調(diào)節(jié),以及整個(gè)細(xì)胞水平上的全局調(diào)節(jié)對(duì)于代謝流的導(dǎo)向和改造是至關(guān)
11、重要的。對(duì)微生物整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行有目的的改造和設(shè)計(jì)涉及到大范圍的遺傳改造。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),18,,,該同化(合成)途徑通過(guò)草酰乙酸 (OAA)與中心代謝途徑相接,天冬氨酸是該族氨基酸的共同前體物。 來(lái)自回補(bǔ)途徑及TCA 環(huán)的草酰乙酸, 進(jìn)入合成途徑并在天冬氨酸 -β- 半醛( ASA)處分為兩條支路,一條通往賴(lài)氨酸,另一條通往蘇氨酸、蛋氨酸( 甲硫氨酸 )及異亮氨酸。該途徑上主要調(diào)控點(diǎn)是天冬氨酸激酶(
12、 AK ),其他重要的酶包括高絲氨酸脫氫酶( HDH ) 和蘇氨酸脫氫酶(TDH)。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),19,,再往后的流量控制點(diǎn)是是通往賴(lài)氨酸 DDP合酶(見(jiàn)圖中DHDPS) 以及賴(lài)氨酸的需能輸出。要獲得令人滿(mǎn)意的結(jié)果,必須全面考慮這些方面,僅僅對(duì)于個(gè)別反應(yīng)(即便是最重要的調(diào)控點(diǎn))進(jìn)行改造并不是理想的方法,Broer 等曾將脫敏的 AK 的基因?qū)胍吧羞M(jìn)行表達(dá),但并未獲得很令人滿(mǎn)意的賴(lài)氨酸產(chǎn)量。,20
13、24/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),20,,該途徑上另一值得關(guān)注的特征是從六氫吡啶二羧酸出發(fā)合成二氨基庚二酸的旁路途徑的出現(xiàn),借助于 NMR 手段已經(jīng)得知,旁路的出現(xiàn)依賴(lài)于某些代謝條件,特別是可利用的NH4+的存在。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),21,,,另一個(gè)重要的方面是參與特定氨基酸合成途徑及與之相關(guān)的其他代謝途徑的酶的調(diào)節(jié)特性,包括酶活力的調(diào)節(jié)和酶的表達(dá)的調(diào)節(jié)。特別是必須詳細(xì)研究中間產(chǎn)物或終端產(chǎn)物對(duì)途徑起點(diǎn)
14、或分支處的關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),22,圖2.,天冬族氨基酸的生物合成及代謝調(diào)節(jié).,(其中 表示反饋抑制; 表示反饋?zhàn)瓒?,,I,,R,縮寫(xiě)符號(hào):ASA為天門(mén)冬氨酸-β-半醛,Hse為高絲氨酸,SucAKPA為琥珀酰二氨基庚二酸;AK為天冬氨酸激酶,DHDPS為二氫吡啶二羧酸合酶,HDH為高絲氨酸脫氫酶,HK為高絲氨酸激酶,TDH為蘇氨酸脫氫酶,AHAS為乙酰羥酸合酶; PEPS為PEP合成
15、酶,PK為丙酮酸激酶,PC為丙酮酸羧化酶,OAADC為草酰乙酸脫羧酶,PEPC為PEP羧化酶,PEPCK為PEP羧激酶。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),23,,要想根據(jù)細(xì)胞粗提取液的測(cè)定結(jié)果對(duì)這些酶的調(diào)控性質(zhì)做出適當(dāng)?shù)慕忉屖强坎蛔〉摹_@一方面是因?yàn)樗鼈冊(cè)谶@些條件下可能不穩(wěn)定;另一方面,對(duì)于需要什么樣的輔因子才能保持它們的活性或(和)它們?cè)诰彌_液中的穩(wěn)定性,也知之甚少;而且特別是因?yàn)樵诔樘岬倪^(guò)程中,那些參與胞內(nèi)酶活性調(diào)節(jié)的
16、必需因子會(huì)丟失。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),24,,谷氨酸棒桿菌中存在 α- 酮戊二酸脫氫酶便是一例。人們最初認(rèn)為這個(gè)酶在谷氨酸棒桿菌中并不存在。正因?yàn)槿绱?,才出現(xiàn)了這樣的假設(shè),即:TCA 環(huán)在該處的中斷引起 α- 酮戊二酸的 “ 溢出 ”, 最終導(dǎo)致谷氨酸的分泌。后來(lái)才弄清這個(gè)酶在谷氨酸棒桿菌中實(shí)際上是存在的,但是它似乎很不穩(wěn)定。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),25,,另外,在關(guān)于代謝流的研究
17、中有跡象表明,在谷氨酸棒桿菌中α-酮戊二酸脫氫酶的活性已被調(diào)低了(dawn-regulated), 但這在細(xì)胞抽提物中至今不能得到證實(shí)。進(jìn)行詳細(xì)的代謝流量(包括相關(guān)中間產(chǎn)物的流量)分析,或許是解決這一問(wèn)題的唯一辦法。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),26,,正確描述代謝網(wǎng)絡(luò)的主要節(jié)點(diǎn)的調(diào)控模式是十分必要的,但常常是十分困難的。谷氨酸棒桿菌中丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸節(jié)點(diǎn)的復(fù)合模式就是最好的例子。谷氨酸棒桿菌中PEP、PYR和
18、OAA所構(gòu)成的 “ 奇異三角區(qū) ”(magic triangle)是研究的熱點(diǎn) 。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),27,,Glc,,PEP,,,PYR,,AcCoA,OAA,,,,,,①,②,③,,,G6P,Glc,④,⑤,⑥,,注:①PK, ②PC,③PEPC, ④PEPCK,⑤OAADC,⑥PEPS, ⑦PTS,奇異三角區(qū),⑦,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),28,,PEP通過(guò)PYR
19、和AcCoA向TCA環(huán)提供C2單位,同時(shí),PEP、PYR 以及 AcCoA 還通過(guò)回補(bǔ)反應(yīng)( 通過(guò)乙醛酸環(huán))為T(mén)CA環(huán)提供重要中間產(chǎn)物,這些回補(bǔ)反應(yīng)對(duì)于以TCA環(huán)代謝中間產(chǎn)物 為前體的氨基酸的生產(chǎn)來(lái)說(shuō)是非常必要的。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),29,該區(qū)包含可能有多達(dá)七個(gè)酶的參與,其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶( PEPCK )、丙酮酸激酶 ( PK )、 草酰乙酸脫羧酶 (OA
20、ADC )和磷酸烯醇式丙酮酸磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)都已得到鑒定,磷酸烯醇式丙酮酸合成酶( PEPS )已被假定存在。丙酮酸羧化酶( PC )的存在已得到代謝流量分析的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),30,,合成代謝途徑通常受反饋抑制和反饋?zhàn)瓒舻膰?yán)格調(diào)控,比如 圖2 中的AK、HDH、TDH、AHAS等。 不過(guò),相對(duì)于大腸桿菌而言,谷氨酸棒桿菌中的調(diào)節(jié)尤其是天冬族氨基酸合成途徑的調(diào)節(jié)還是比較簡(jiǎn)單的。,20
21、24/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),31,,,研究表明,僅僅研究與合成途徑直接相關(guān)的酶的調(diào)節(jié)以及還原力和能量的供給,以及對(duì)“瓶頸”處關(guān)鍵酶的解調(diào)節(jié)或過(guò)量表達(dá)仍是不夠的。中心代謝途徑和合成代謝途徑,特別是合成代謝途徑,同全局調(diào)控機(jī)制密切相關(guān),如緊縮控制、營(yíng)養(yǎng)阻遏、供氧控制、氮源調(diào)節(jié)、滲透壓調(diào)節(jié)及生長(zhǎng)階段調(diào)節(jié)等。這些問(wèn)題對(duì)于氨基酸的合成非常重要,但對(duì)它們了解得并不多。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),32,,氨基酸的生產(chǎn)
22、中經(jīng)常用到特定的氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。一方面,在分成兩支的氨基酸合成途徑中,一個(gè)分支途徑的終端產(chǎn)物氨基酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷,通常對(duì)另一分支的終端產(chǎn)物氨基酸的合成起促進(jìn)作用。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),33,,(其中 表示反饋抑制; 表示反饋?zhàn)瓒?,比如圖 3 中,谷氨酸棒桿菌中高絲氨酸缺陷或蘇氨酸缺陷的賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株,大腸桿菌中甲硫氨酸缺陷、二氨基庚二酸缺陷或異亮氨酸缺陷的蘇氨酸生產(chǎn)菌株。,2024/3/19,張星元:
23、發(fā)酵原理(講座),34,,另一方面,某些化合物對(duì)菌體生長(zhǎng)的限制,不論是氨基酸或其他化合物( 比如磷酸鹽 ), 都可能成為有利于特定生物過(guò)程的最優(yōu)控制的技術(shù)條件。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),35,盡管連續(xù)培養(yǎng)得到的結(jié)果表明,賴(lài)氨酸的生成是與細(xì)胞的生長(zhǎng)是相關(guān)聯(lián)的。但在有效分泌的生理?xiàng)l件下,氨基酸生產(chǎn)菌一般都處于生長(zhǎng)受限制的狀態(tài)。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),36,然而,對(duì)于與生長(zhǎng)限制相關(guān)的中心代謝( c
24、entral metabolism ) 和外圍代謝(peripheral metabolism) 的改變?nèi)绾斡绊懓被岬挠行?,還不很清楚;這或許與影響到許多不同的基因和操縱子的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò) ( regulatory networks ) 的作用有關(guān)。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),37,,谷氨酸的生產(chǎn)可以建筑在完全不同的細(xì)胞代謝態(tài)勢(shì)下。許多方法可誘導(dǎo)其分泌,包括生物素饑餓法(用于谷氨酸生產(chǎn)的谷氨酸棒桿菌是生物素缺陷型)、
25、添加胺類(lèi)表面活性劑、在菌體生長(zhǎng)期添加青霉素、甘油或脂肪酸缺陷菌株在限制條件下生長(zhǎng)等。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),38,很顯然,所使用的這些方法都對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜或細(xì)胞壁有一定影響,但使細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化的機(jī)理是不完全一樣的。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),39,,谷氨酸的分泌曾被認(rèn)為是因?yàn)橄鄬?duì)簡(jiǎn)單和直接的代謝改變(即影響細(xì)胞膜性質(zhì))的而引起的,然而最近發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有緊縮效應(yīng)的大腸桿菌(rel A 基因缺損)中
26、,通過(guò)氨基酸饑餓法可以觸發(fā)細(xì)胞的借助于載體的谷氨酸分泌活性,這表明全局調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)分泌的影響是存在的。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),40,,,,1.2 氨基酸生產(chǎn)的微生物生理學(xué) 對(duì)于經(jīng)氧化還原過(guò)程實(shí)現(xiàn)氨基酸生產(chǎn)的重要性,早有所認(rèn)識(shí)。但對(duì)其中大多數(shù)現(xiàn)象(至少在分子水平上)仍未很好理解。對(duì)一般的代謝調(diào)節(jié)現(xiàn)象做如下五點(diǎn)概述,可能將有利于我們從生理學(xué)的角度去理解代謝中間產(chǎn)物的生產(chǎn)。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(
27、講座),41,(1) 氨基酸的生產(chǎn)與菌體生長(zhǎng)之間的關(guān)系尚未解決(耦合與否?)。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),42,,(2) 限制生長(zhǎng)條件下的微生物生理。 在緩慢生長(zhǎng)或非生長(zhǎng)條件下,有目的地控制基質(zhì)的吸收與代謝的速率,能提高發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)效率。因此,要用分子技術(shù)或生化技術(shù)對(duì)此進(jìn)行深入細(xì)致的研究,以闡明在限制生長(zhǎng)條件下,微生物的生理背景同工業(yè)生物過(guò)程的應(yīng)用必定密切相關(guān)的道理。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),4
28、3,,(3)溢出代謝的概念: 當(dāng)這個(gè)生理學(xué)的新見(jiàn)識(shí)同過(guò)量生產(chǎn)的特定代謝條件,在分子水平上發(fā)生相互關(guān)聯(lián)的時(shí)候,溢出代謝(overflow metabolism)的概念是值得關(guān)注的。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),44,例如,在過(guò)量生產(chǎn)某種產(chǎn)物的代謝條件下,已觀察到某些特有的代謝中間產(chǎn)物,如 丙酮酸、 α- 酮戊二酸等,會(huì)大量分泌。這些特定的代謝中間產(chǎn)物先在細(xì)胞內(nèi)累積(這取決于碳源的性質(zhì)和生長(zhǎng)限制),然后分泌到細(xì)胞外(如果
29、細(xì)胞具備允許這些代謝中間產(chǎn)物跨膜機(jī)構(gòu)或有輸送系統(tǒng)存在),從而抵消在碳架物質(zhì)、還原當(dāng)量和代謝能等在代謝中的不平衡。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),45,,(4)代謝不平衡: 細(xì)胞的代謝不平衡指碳架物質(zhì)不平衡,特別是指代謝能和還原當(dāng)量的不平衡。代謝不平衡的條件常常涉及到溢流閥( overflow valves )的功能。事實(shí)上,代謝網(wǎng)絡(luò)之所以能夠在失去平衡的條件下(如大量氨基酸的過(guò)量合成 )得以維持,是因?yàn)樗邆涫雇ǔG闆r
30、下(指碳架物質(zhì)和代謝能限制的條件下 )耦合在一起的代謝流脫鉤的靈活性。 好幾個(gè)術(shù)語(yǔ),如 “ 解耦聯(lián) ”、“ 代謝能溢出 ” 等就是用來(lái)說(shuō)明這種靈活性的。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),46,,實(shí)際上,曾有人這樣描述過(guò)細(xì)菌的這種行為:“ 可以推斷,細(xì)菌對(duì)于代謝能過(guò)剩的解決辦法是把它浪費(fèi)(用)掉 ”。然而,對(duì)特定條件下(如與不生長(zhǎng)發(fā)生耦合或耦合欠佳的氨基酸的生產(chǎn)條件下)代謝能耗散的機(jī)制,尚待進(jìn)行深入的研究。,2024/
31、3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),47,,在細(xì)菌中存在很多能夠浪費(fèi)代謝能的反應(yīng)和反應(yīng)組合。如 K+ 離子或 NH4+ 的無(wú)效循環(huán),(在某些情況下也會(huì)發(fā)生)質(zhì)子的無(wú)效循環(huán)。這樣的代謝能溢出反應(yīng)表明,合成代謝與分解代謝之間存在不平衡, 而這正是氨基酸生產(chǎn)菌種所希望得到滿(mǎn)足的條件。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),48,,其實(shí),關(guān)于谷氨酸棒桿菌的賴(lài)氨酸生產(chǎn)的能量溢出問(wèn)題已有過(guò)爭(zhēng)論,賴(lài)氨酸生產(chǎn)的最大轉(zhuǎn)化率可能受到過(guò)
32、量的代謝能的約束。賴(lài)氨酸的合成的高度增加使代謝發(fā)生改變,引起代謝能的過(guò)剩。因此,可以認(rèn)為高的能量耗散能力適合于代謝中間產(chǎn)物(如氨基酸)的過(guò)量合成。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),49,,(5)有關(guān)滲透適應(yīng)性問(wèn)題: 在分批培養(yǎng)的條件下,醪液中溶質(zhì)(碳源和能源)的濃度會(huì)發(fā)生很大的變化,那么了解和控制有關(guān)滲透適應(yīng)性的代謝過(guò)程顯然就相當(dāng)重要了。細(xì)胞外部滲透壓(實(shí)際上是水活度)的改變不但對(duì)細(xì)胞的代謝,而且對(duì)基
33、質(zhì)的吸收、產(chǎn)物的釋放都會(huì)產(chǎn)生有效的影響。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),50,,關(guān)于真細(xì)菌這方面的基本機(jī)制的研究,可能促使我們?nèi)ミx育已喪失以下兩種能力的菌株: 一是喪失對(duì)不利于生產(chǎn)的滲透保護(hù)物質(zhì)(如海藻糖)的合成能力;二是喪失對(duì)代謝和輸送反應(yīng)做出滲透壓響應(yīng)的能力。,,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),51,,,2. 氨基酸生物合成的代謝流量分析 除了代謝途徑及其調(diào)節(jié)機(jī)制和已知
34、途徑的化學(xué)計(jì)量分析以外,穩(wěn)態(tài)代謝流量和流量動(dòng)力學(xué)分析對(duì)于理解氨基酸生產(chǎn)的代謝網(wǎng)絡(luò)也越來(lái)越重要。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),52,,這既涉及到提供碳架物質(zhì)、 氧化還原當(dāng)量和代謝能的中心代謝途徑,也涉及到那些通往特定氨基酸的合成代謝途徑。代謝流量分析和代謝流的動(dòng)力學(xué)分析的一個(gè)主要目的在于鑒定代謝網(wǎng)絡(luò)中所一般認(rèn)為的限速步驟。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),53,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),
35、54,,主要可通過(guò)兩種不同的方法定量地、完整地描述細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò):(1)描述各步反應(yīng)(酶)的動(dòng)力學(xué)屬性及其他有用數(shù)據(jù)的方法;(2)直接測(cè)定基質(zhì)、產(chǎn)物及一些代表性中間產(chǎn)物的方法,如物料平衡 ( 代謝物平衡)技術(shù)。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),55,,如果要對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)做出完整描述并且對(duì)各步反應(yīng)及其代謝物流量的重要程度做出評(píng)價(jià),就要弄清每一個(gè)酶的的調(diào)節(jié)(包括對(duì)酶的活性的調(diào)節(jié)和對(duì)表達(dá)水平的調(diào)節(jié))情況,這當(dāng)然是不容易如愿的,
36、但已被實(shí)踐證明,以下簡(jiǎn)化的策略也可以用來(lái)對(duì)代謝流進(jìn)行定量的描述。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),56,,第一種方法,在某些場(chǎng)合下用代謝控制理論來(lái)對(duì)有關(guān)生物技術(shù)學(xué)的研究進(jìn)行反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的分析。其基本原理就是分析酶活力或酶濃度的微量變化對(duì)代謝流量及代謝物濃度的影響,進(jìn)而確定特定的流量控制系數(shù) ( flux control coefficients ),該系數(shù)反映特定反應(yīng)對(duì)復(fù)雜途徑的影響程度。另一種更常用的理論是生化系統(tǒng)理論
37、(略)。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),57,,第二種方法,代謝物平衡技術(shù)。其模式的推導(dǎo)建立在對(duì)基質(zhì)、產(chǎn)物及某些重要中間產(chǎn)物的直接測(cè)定上。這種方法已在谷氨酸棒桿菌生物合成賴(lài)氨酸的研究中得到了應(yīng)用。如果所研究的代謝網(wǎng)絡(luò)的途徑結(jié)構(gòu)已知,又假定進(jìn)行穩(wěn)態(tài)代謝,那么就可通過(guò)準(zhǔn)確測(cè)得的所有進(jìn)出細(xì)胞代謝流的流量,推導(dǎo)出特定途徑的代謝流量分布。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),58,,但用這類(lèi)方法計(jì)算,很難把代謝環(huán)路( 如
38、TCA環(huán) )、重要節(jié)點(diǎn)( 如 PYR、 PEP 節(jié)點(diǎn) ) 、以及平衡反應(yīng)(酶促反應(yīng)的正向和逆向流量)的特殊重要性包羅在內(nèi)。這是這類(lèi)方法的局限性。為了彌補(bǔ)這種局限性,近年已有幾種技術(shù)用到這種類(lèi)型的分析中去了。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),59,,如采用示蹤流量實(shí)驗(yàn)(tracer flux experiments )技術(shù)、快速取樣技術(shù)及核磁共振(NMR)技術(shù)可獲得關(guān)于代謝流分布的另外一些信息, 如代謝網(wǎng)絡(luò)的有關(guān)組成部分中
39、的流量分布、 胞內(nèi)不同代謝產(chǎn)物的累積量, 以及它們各自隨時(shí)間而變化的情況。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),60,,有人分析了谷氨酸棒桿菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、賴(lài)氨酸生產(chǎn)期(生物素量足夠)及谷氨酸生產(chǎn)期(生物素限量)等條件下胞內(nèi)代謝流的不同分布情況( 下圖),它們以13C 標(biāo)記的葡萄糖為碳源進(jìn)行分批發(fā)酵,然后運(yùn)用 NMR 測(cè)定標(biāo)記了的代謝物,同時(shí)運(yùn)用質(zhì)量平衡法進(jìn)行計(jì)算,得到了圖中的流量分布圖,或稱(chēng)代謝斷面 ( section
40、s of the metabolism )圖。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),61,,,,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),62,,由圖可見(jiàn),在不同條件下,流量發(fā)生了顯著的變化。酵解途徑的 HMP 旁路的流量分布在賴(lài)氨酸生成時(shí)增加,而在谷氨酸生成時(shí)則下降。在氨基酸分泌的情況下,回補(bǔ)反應(yīng)變得更重要一些。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),63,,另一個(gè)長(zhǎng)期以來(lái)不能確定的問(wèn)題也在研究中得到了解決,也
41、就是氨基酸生成條件下 GOA 環(huán)活力的問(wèn)題,在氨基酸生成條件下, GOA 環(huán)的活力實(shí)測(cè)是非常低的。 下圖為在不同轉(zhuǎn)化率時(shí)的理論流量分布圖。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),64,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),65,,課外學(xué)習(xí)參考資料:Metabolic Pathway Synthesis (p288)Metabolic Flux Analysis (p309)in Meta
42、bolic Engineering, 1998Metabolic Flux Balance Analysis (p13) in Metabolic Engineering, 1999,,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),66,,,,3. 基質(zhì)的跨膜吸收與氨基酸的跨膜輸出 基質(zhì)的吸收和產(chǎn)物的輸出對(duì)于氨基酸的生成是非常重要的。對(duì)于某些細(xì)菌,特別是大腸桿菌對(duì)基質(zhì)吸收的不同機(jī)制已作了詳盡的研究,但對(duì)于其它生物
43、工程有關(guān)的微生物,如谷氨酸棒桿菌的蔗糖及羧酸的吸收機(jī)制則知之甚少。而關(guān)于產(chǎn)物氨基酸怎樣跨過(guò)膜而被分泌出細(xì)胞的問(wèn)題,似乎或多或少被忽略掉了。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),67,,近年的研究表明,在氨基酸生產(chǎn)的條件下, “ 氨基酸被動(dòng)擴(kuò)散跨過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜 ” 這一設(shè)想是武斷的。谷氨酸棒桿菌中至少有谷氨酸、賴(lài)氨酸、異亮氨酸及蘇氨酸,以及大腸桿菌中谷氨酸和蘇氨酸,都是借助于載體的輸送過(guò)程,而且不純粹是被動(dòng)的。而運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zy
44、momonas mobilis)的重組菌株中,丙氨酸則是依靠簡(jiǎn)單擴(kuò)散機(jī)制來(lái)分泌。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),68,,詳細(xì)了解特定氨基酸跨過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜滲透屏障的機(jī)理,對(duì)于提高發(fā)酵過(guò)程的效率和轉(zhuǎn)化率也非常重要。盡管采用細(xì)菌來(lái)生產(chǎn)氨基酸往往可以獲得極高的胞外氨基酸濃度,人們卻并未意識(shí)到這至少部分是由于細(xì)胞向載體系統(tǒng)所催化的分泌反應(yīng)提供了代謝能的結(jié)果。這一點(diǎn)已被有關(guān)賴(lài)氨酸和異亮氨酸分泌的研究所證實(shí) 。,2024/3/19,張星
45、元:發(fā)酵原理(講座),69,,下圖顯示了谷氨酸棒桿菌在異亮氨酸生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)生的不同流量。所觀察到的異亮氨酸的凈產(chǎn)量實(shí)際上是借助于載體而形成的向外分泌的流量、向內(nèi)吸納的流量及擴(kuò)散流量的代數(shù)和。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),70,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),71,,在分批發(fā)酵的開(kāi)始階段,異亮氨酸從胞內(nèi)向胞外擴(kuò)散,但隨著胞外異亮氨酸濃度的增加,其擴(kuò)散方向也發(fā)生改變,并越來(lái)越多地抵消異亮氨酸載體系統(tǒng)的分泌作用
46、。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),72,這一方面解釋了所能獲得的最大胞外濃度取決于異亮氨酸對(duì)質(zhì)膜的透性常數(shù),以及分泌和吸收載體的活力;另一方面,由此可看出在生產(chǎn)條件下可能發(fā)生由代謝能驅(qū)動(dòng)的分泌與被動(dòng)回流構(gòu)成的無(wú)效循環(huán)是浪費(fèi)代謝能的。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),73,一般說(shuō)來(lái),抵消氨基酸的產(chǎn)量的氨基酸的吸收系統(tǒng)對(duì)于整個(gè)過(guò)程并不重要。用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)賴(lài)氨酸時(shí),吸收系統(tǒng)的活力非常低。最近發(fā)現(xiàn),芳香族氨基酸
47、的吸收系統(tǒng)過(guò)量表達(dá)的結(jié)果是相應(yīng)氨基酸的吸收的增加,實(shí)際上產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率降低了。總之,深入了解氨基酸吸收和分泌的能學(xué)及調(diào)控的機(jī)理對(duì)于定量地理解氨基酸的生產(chǎn)過(guò)程是極為重要的。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),74,在進(jìn)行包括輸送途徑的代謝流量的詳細(xì)分析時(shí),特別是在比較野生株和生產(chǎn)菌株,或特定菌株在生產(chǎn)或非生產(chǎn)條件下的性質(zhì)時(shí),已引出了幾個(gè)重要的概念。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),75,單靠“ 瓶頸 ” 酶的過(guò)量
48、表達(dá)并不能獲得理想的高產(chǎn)結(jié)果:在通常情況下,僅僅是從基質(zhì)到產(chǎn)物整條途徑的某 “ 瓶頸 ” 酶的過(guò)量表達(dá)并不能獲得理想的高產(chǎn)結(jié)果。對(duì)生產(chǎn)菌株的分析表明,為了使得特定氨基酸能夠穩(wěn)定而有效地分泌,應(yīng)該對(duì)酶和途徑進(jìn)行細(xì)致的調(diào)整。只有當(dāng)一系列酶發(fā)生了協(xié)調(diào)的改變,才能避免細(xì)胞內(nèi)代謝中間產(chǎn)物庫(kù)的虧空或積壓,避免代謝不平衡或不必要的副反應(yīng)。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),76,用谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌和酵母菌進(jìn)行了有關(guān)芳香族氨基酸的成功
49、的研究。關(guān)于谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌的代謝途徑工程研究的成果已見(jiàn)發(fā)表。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),77,為提高色氨酸的產(chǎn)量,已對(duì)谷氨酸棒桿菌按部就班地進(jìn)行了一系列的遺傳調(diào)節(jié),包括:色氨酸操縱子(已被解除調(diào)節(jié)的)的基因的過(guò)量表達(dá)、去除調(diào)節(jié)子及弱化序列的控制;切斷通往苯丙氨酸和酪氨酸的支路、增加前體物如 PEP、E-4-P和絲氨酸等的供應(yīng)、破壞色氨酸酶的降解色氨酸的活性等等。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),
50、78,,,HMP,,,EMP,,,,PEP,,,,,,,E4P,,,,,,,DAHP,,,,莽草酸,,,,分支酸,,,,預(yù)苯酸,鄰氨基苯甲酸,,,,,,,,,,,,,,,,Phe,Tyr,,,,,,,,,,,,,Trp,,,,PRPP,,,,,,,Ser,,,,,,,,,,降解產(chǎn)物,,,,大腸桿菌中色氨酸合成途徑的簡(jiǎn)圖該圖略去了酶活力及基因表達(dá)水平上的調(diào)控機(jī)制,實(shí)際上在生產(chǎn)菌株中,這些調(diào)控機(jī)制都已被解除。,2024/3/19,張星元
51、:發(fā)酵原理(講座),79,雖然一般用于芳香族氨基酸生產(chǎn)的微生物并不是釀酒酵母,但在概念探討方面,用酵母進(jìn)行的色氨酸生物合成的研究是引人關(guān)注的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,即使在無(wú)分支的途徑中,想靠單個(gè)酶 “上調(diào)(up-modulation)”,增加整條途徑的流量往往是無(wú)濟(jì)于事的。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),80,正如基于流量控制理論的理論解釋?zhuān)挥袔追N酶活性協(xié)同地提高,才有可能大幅度增加流向色氨酸的全程的流量。這個(gè)發(fā)現(xiàn)為許多途徑中
52、的關(guān)于“分?jǐn)偸降拇x控制(distributive metabolic control)”的更加籠統(tǒng)的描述提供了支持;同時(shí)也對(duì)仍在廣泛使用的代謝途徑的所謂“瓶頸”識(shí)別方法做出了一個(gè)重要的限制。,,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),81,4. 氨基酸生產(chǎn)的代謝設(shè)計(jì),氨基酸生產(chǎn)上廣泛使用棒狀桿菌,這一方面有歷史的原因;另一方面,與其他微生物如大腸桿菌相比較,棒狀桿菌在工業(yè)生產(chǎn)上具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
53、,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),82,棒狀桿菌的代謝調(diào)節(jié)相對(duì)簡(jiǎn)單。腸道細(xì)菌中特定反應(yīng)的酶及特定基質(zhì)的載體系統(tǒng)具有多重性,而棒狀桿菌中則沒(méi)有;棒狀桿菌的代謝調(diào)控模式也比大腸桿菌要簡(jiǎn)單得多。然而,利用腸道細(xì)菌進(jìn)行氨基酸菌種的育種的優(yōu)勢(shì)則在于可以方便地應(yīng)用成熟的現(xiàn)代 DNA 重組技術(shù),有效地進(jìn)行氨基酸生產(chǎn)菌種的改造。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),83,針對(duì)于不同的目的和不同水平的復(fù)雜性,在考慮代謝設(shè)計(jì)的策略
54、時(shí)應(yīng)區(qū)別對(duì)待。 代謝設(shè)計(jì)的目標(biāo)在于: (1)提高已建立的途徑或過(guò)程的效率; (2)將代謝流導(dǎo)向至新插入的途徑。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),84,第一個(gè)目標(biāo)可通過(guò)多種手段來(lái)實(shí)現(xiàn):①擴(kuò)展基質(zhì)利用的范圍②改善生長(zhǎng)條件;③增大通往特定氨基酸合成途徑的代謝流;④調(diào)大通往目的產(chǎn)物的支路和調(diào)小通往副產(chǎn)物的支路。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),85,這些對(duì)關(guān)鍵酶的活性或調(diào)節(jié)
55、機(jī)制的改良可大大增加最終要被分泌的終端產(chǎn)物氨基酸的胞內(nèi)濃度。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),86,,第二個(gè)目標(biāo)即引入新的途徑,以便在不同的代謝期合成新的產(chǎn)物??赏ㄟ^(guò)類(lèi)似但不同的方法來(lái)實(shí)現(xiàn):①延長(zhǎng)特定的代謝途徑;②引入新的代謝分支途徑;③從特定生物引入的全新的途徑。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),87,,盡管谷氨酸棒桿菌中通往賴(lài)氨酸的流量控制點(diǎn)主要分布在天冬氨酸激酶、DDP合成酶和賴(lài)氨酸分泌系統(tǒng),但
56、如果考慮到通往蘇氨酸和異亮氨酸的途徑,情況就更加復(fù)雜了。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),88,十多年前,曾有人做過(guò)把谷氨酸棒桿菌中碳架流導(dǎo)向蘇氨酸的開(kāi)創(chuàng)性研究,其方法是擴(kuò)增蘇氨酸合成途徑起始端的兩個(gè)酶高絲氨酸脫氫酶和高絲氨酸激酶的基因(hom 和 thrB ), 以及解除對(duì)高絲氨酸脫氫酶的反饋調(diào)節(jié)。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),89,最近有一項(xiàng)有啟發(fā)性的研究將一株賴(lài)氨酸的生產(chǎn)菌株(出發(fā)菌株)逐步轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>
57、蘇氨酸生產(chǎn)菌株,其方法是將突變株的 hom - thrB 操縱子(指為已解除調(diào)節(jié)的高絲氨酸脫氫酶和高絲氨酸激酶編碼的操縱子)不同拷貝數(shù)整合到出發(fā)菌株的染色體DNA上。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),90,盡管出發(fā)菌株可有效地分泌賴(lài)氨酸及少量的甘氨酸,但當(dāng)整合到染色體 DNA 上的 hom-thrB操縱子的拷貝數(shù)為1~3時(shí),蘇氨酸的分泌量則顯著增加,同時(shí)賴(lài)氨酸的產(chǎn)量則下降了原來(lái)的四分之一。,2024/3/19,張星元
58、:發(fā)酵原理(講座),91,如果以該蘇氨酸生產(chǎn)菌株作為出發(fā)株,也同樣可采用類(lèi)似的策略將解除調(diào)節(jié)的蘇氨酸脫水酶和乙酰羥酸合成酶(從蘇氨酸到異亮氨酸的合成途徑的第一和第二個(gè)酶)引入異亮氨酸的合成途徑。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),92,以前,此類(lèi)研究的主要目標(biāo)就是鑒別被認(rèn)為必須改變或繞過(guò)的所謂的 “ 瓶頸反應(yīng) ”。對(duì)于第一步反應(yīng)受到反饋調(diào)節(jié)的某些合成途徑,這一方法的確有效。并且,這一方法是運(yùn)用代謝擷頏物(如合成途徑的終端產(chǎn)
59、物氨基酸的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物)成功地實(shí)現(xiàn)育種策略的基礎(chǔ)。這些代謝擷頏物的抗性突變株的突變,常常是發(fā)生在一個(gè)反饋調(diào)節(jié)的主要反應(yīng)步驟(一般被叫做“代謝瓶頸”)所對(duì)應(yīng)的基因上。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),93,最典型的例子當(dāng)屬針對(duì)谷氨酸棒桿菌賴(lài)氨酸合成途徑中的天門(mén)冬氨酸激酶的工作。賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌種一般是賴(lài)氨酸的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物AEC(aminoethyl cystein)的抗性突變株。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),94,
60、然而分子水平的實(shí)驗(yàn)證實(shí),即便是在這種情況下,這種簡(jiǎn)單的方法仍不能導(dǎo)致賴(lài)氨酸的高效合成。顯然,通過(guò)隨機(jī)誘變和篩選所得到的高產(chǎn)菌株,其代謝網(wǎng)絡(luò)已發(fā)生了許多改變。從很多例子都可推斷,單單改變某一 “ 重要的 ” 步驟(“瓶頸”)并不一定能實(shí)現(xiàn)氨基酸的過(guò)量合成。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),95,因?yàn)閷?duì)于長(zhǎng)而復(fù)雜的代謝途徑而言,絕對(duì)的單個(gè)限速步驟幾乎是不存在的。換言之,整條途徑在代謝網(wǎng)絡(luò)范圍內(nèi)已經(jīng)是調(diào)整好了的,“分?jǐn)偸降拇x調(diào)
61、控”(整條途徑上的代謝調(diào)控實(shí)際上是由許多個(gè)步驟共同分擔(dān))的發(fā)現(xiàn)也說(shuō)明了這個(gè)問(wèn)題。這對(duì)于有目的的代謝設(shè)計(jì)是有重要意義的。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),96,,僅僅提高合成途徑的流量往往并不足以將代謝流導(dǎo)向特定氨基酸,實(shí)現(xiàn)特定氨基酸的過(guò)量合成。為了增加氨基酸的生產(chǎn),增加關(guān)鍵前體物的供應(yīng)量也是十分重要的。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),97,關(guān)鍵前體物的供應(yīng) 可通過(guò)中間代謝的反應(yīng) (如 TCA 環(huán)的回補(bǔ)反
62、應(yīng)支持 TCA 環(huán)中間產(chǎn)物的供應(yīng)、EMP 途徑和 HMP 途徑分別為芳香族氨基酸的合成提供磷酸烯醇式丙酮酸和4 - 磷酸赤蘚糖 ) , 或者在培養(yǎng)基中額外添加特定前體物供微生物細(xì)胞吸收和利用。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),98,,,當(dāng)對(duì)合成途徑進(jìn)行修飾或?qū)驎r(shí),中心代謝途徑的反應(yīng)出乎意料地成了限制因素;這一點(diǎn)再次強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞代謝通常已得到有效的調(diào)節(jié),這也就意味著許多不同反應(yīng)之間的最佳平衡和秩序井然的分?jǐn)偸娇刂聘?/p>
63、蓋了代謝網(wǎng)絡(luò)的大部分。只有當(dāng)合理延伸的代謝網(wǎng)絡(luò)片段以一種協(xié)調(diào)的方式得到有目的的改變時(shí),代謝流大規(guī)模的導(dǎo)向才能最終導(dǎo)致最優(yōu)的結(jié)果。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),99,,總體來(lái)說(shuō),副產(chǎn)物的形成可以通過(guò)兩種策略來(lái)避免:,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),100,最有利的方法是充分地調(diào)動(dòng)所研究的途徑,這樣就不會(huì)形成大量通往副產(chǎn)物的中間產(chǎn)物了;另一種方法是使從目的氨基酸的合成途徑分出通往副產(chǎn)物合成的分支的第一個(gè)酶失活
64、。前文所述的在生產(chǎn)色氨酸的大腸桿菌菌株中,去除色氨酸酶,就是這一策略的一個(gè)成功應(yīng)用;這樣就堵死了色氨酸過(guò)量合成條件下色氨酸的主要消耗。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),101,,當(dāng)引入新的途徑或者改變已建立的代謝途徑上代謝流的流向時(shí),除了要考慮碳架流,還考慮氧化還原平衡和代謝能平衡。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),102,,對(duì)氨基酸產(chǎn)生菌的代謝途徑的大規(guī)模導(dǎo)向會(huì)出現(xiàn)一些問(wèn)題。實(shí)際上,一般氨基酸的分泌,特別是
65、谷氨酸棒桿菌中谷氨酸的分泌被解釋為氧化還原作用失去平衡的結(jié)果,谷氨酸的分泌在供氧條件的試驗(yàn)過(guò)程中,觀察到一個(gè)明顯最佳狀態(tài)。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),103,,在谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)賴(lài)氨酸或谷氨酸的條件下,不僅碳架流會(huì)發(fā)生較大的變化,糖酵解途徑(產(chǎn)生NADH)和磷酸戊糖途徑(產(chǎn)生 NADPH)間的流量分配也必定會(huì)發(fā)生巨大的變化。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),104,,此外,從理論上推測(cè)谷氨酸棒桿菌賴(lài)氨酸
66、最大產(chǎn)量的獲得在很大程度上依賴(lài)于細(xì)胞的 NADPH 的水平。然而,曾嘗試過(guò)確定賴(lài)氨酸生產(chǎn)條件下 NADPH 的真實(shí)化學(xué)計(jì)量,并嘗試將其同其他合成反應(yīng)進(jìn)行比較,結(jié)果驚奇地發(fā)現(xiàn) NADPH 是大大過(guò)量的,這一點(diǎn)至今還無(wú)法解釋。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),105,,這些結(jié)果再次強(qiáng)調(diào)還原力定量分析的重要性,其對(duì)于氨基酸生產(chǎn)菌株總體流量的進(jìn)一步優(yōu)化,也具有潛在的重要性。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),1
67、06,,關(guān)于代謝能平衡的量化問(wèn)題,就目前而言,幾乎還是空白。在氨基酸生產(chǎn)方面,因?yàn)殛P(guān)于還原力平衡的問(wèn)題已有一些討論,能量平衡問(wèn)題就常常被忽略。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),107,除了 ATP 的形成過(guò)程和已知的ATP消耗過(guò)程之間的不平衡,氨基酸過(guò)量合成顯然遠(yuǎn)非僅僅與能量的輸入和輸出的“偶聯(lián)”或“贏利”。如上所述,代謝能的重大消耗一般都能觀察到,這種損耗一方面甚至?xí)拗飘a(chǎn)物對(duì)基質(zhì)的轉(zhuǎn)化率,另一方面也可能是增加特定產(chǎn)物
68、分泌的基礎(chǔ)。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),108,氨基酸的過(guò)量生產(chǎn)可由兩種不同的代謝狀態(tài)引起。諸如賴(lài)氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸及芳香族氨基酸等可通過(guò)解除合成途徑的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)過(guò)量分泌;而谷氨酸的分泌在許多細(xì)菌中則是對(duì)環(huán)境壓力的響應(yīng)。因此,如上所述,這兩種情況下的研究策略也是不同的。,2024/3/19,張星元:發(fā)酵原理(講座),109,,要改善氨基酸的生產(chǎn),除了碳架流方面以外,在還原力控制和能量代謝方面還有很多工作等待著我們
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