食品中化學(xué)物質(zhì)的生殖發(fā)育毒性和致畸作用及評(píng)價(jià)

1、本章學(xué)習(xí)目的與要求,掌握：生殖、發(fā)育毒性試驗(yàn)的基本概念生殖毒性和發(fā)育毒性的表現(xiàn)生殖毒性試驗(yàn)和發(fā)育毒性試驗(yàn)的觀(guān)察指標(biāo)理解：生殖毒性和發(fā)育毒性評(píng)價(jià)的試驗(yàn)方法和設(shè)計(jì)原理了解：生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)的體外代替試驗(yàn),第一節(jié) 概述,生殖是使種族延續(xù)的各種生理過(guò)程的總稱(chēng)。生殖過(guò)程一般是指從配子形成直到胎兒娩出的整個(gè)過(guò)程。其中包括精子的發(fā)生、卵的形成、配子的釋放、受精、卵裂和胚泡發(fā)育、著床、胚胎發(fā)生、胎兒發(fā)育、分娩。胎兒的娩出也并不意味著

2、胎兒發(fā)育成熟的終止，從廣義上說(shuō)生殖還應(yīng)包括胎兒娩出后的新生兒期、哺乳期、直到性成熟的整個(gè)過(guò)程。,生殖毒性,發(fā)育（子體）毒性,生殖系統(tǒng)（親體）毒性,胚胎發(fā)育,胎兒發(fā)育,產(chǎn)后發(fā)育至性成熟,性欲、性行為,配子產(chǎn)生,生殖結(jié)局,激素水平,,,,一、外源化學(xué)物對(duì)生殖發(fā)育的影響,干擾生殖發(fā)育的任何環(huán)節(jié)，并造成損害作用。可以通過(guò)對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)，特別是對(duì)性腺的作用，發(fā)生間接的影響。神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)內(nèi)分泌功能也有調(diào)節(jié)作用，通過(guò)下丘腦-垂體-睪丸軸(下丘腦

3、-垂體-卵巢軸)兩條途徑作用于生殖發(fā)育過(guò)程 。,二、外源化學(xué)物對(duì)生殖發(fā)育損害作用的特點(diǎn),生殖發(fā)育過(guò)程較機(jī)體其他系統(tǒng)更為敏感 例如：妊娠期接觸過(guò)不足以引起腫瘤的低劑量二乙基亞硝胺，仔鼠成年后再次接觸，則腫瘤發(fā)生率增加。 外源化學(xué)物對(duì)生殖發(fā)育過(guò)程影響的范圍較為廣泛和深遠(yuǎn)。 例如：母鼠接觸高濃度二硫化碳引起致畸作用，其子一代既使不再接觸二硫化碳，交配后所生的子二代仔鼠也出現(xiàn)與子一代仔鼠幾乎完全相同的畸變類(lèi)型。,生殖發(fā)育毒理學(xué)：研

4、究出生前暴露于環(huán)境有害因子導(dǎo)致的異常發(fā)育結(jié)局及有關(guān)的作用機(jī)制、發(fā)病原理、影響因素和毒物動(dòng)力學(xué)等的學(xué)科。生殖毒理學(xué)(reproductive toxicology)主要研究外源化學(xué)物對(duì)生殖細(xì)胞發(fā)生、卵細(xì)胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳過(guò)程的損害作用。 評(píng)定方法即為生殖毒性試驗(yàn)。發(fā)育毒理學(xué)(developmental toxicology)主要研究外源化學(xué)物對(duì)胚胎發(fā)育、胎仔發(fā)育以及出生幼仔發(fā)育的影響。 評(píng)定方法稱(chēng)為發(fā)育毒性

5、試驗(yàn)，其中主要為致畸試驗(yàn)。,三、基本概念,1940年澳大利亞風(fēng)疹大流行，次年流行嬰兒先天性白內(nèi)障、耳聾、智力不全、先天性心臟病。1945年廣島長(zhǎng)崎原子彈爆炸，受輻射兒童小頭畸形、智力低下，一年內(nèi)死亡率25%。1960年反應(yīng)停事件（thalidomide incident）， 歐洲出生8000多海豹畸形或海豹癥（phocomelus）兒童。1968年日本多氯聯(lián)苯污染米糠油事件，孕婦出現(xiàn)死產(chǎn)、早產(chǎn)、“油癥兒”。1961-1970年美

6、國(guó)在越戰(zhàn)中使用落葉劑2,4,5-T（含TCDD），孕婦流產(chǎn)、產(chǎn)下小頭和Down’s綜合征畸形兒。1966-1972年美國(guó)孕婦服用己烯雌酚，女性后代青春期陰道癌，男性后代成年后性功能低下、精子數(shù)下降。,四、歷史上的教訓(xùn),一、基本概念,1．發(fā)育毒性(developmental toxicity),指出生前經(jīng)父體和(或)母體接觸外源性理化因素引起的在子代到達(dá)成體之前出現(xiàn)的有害作用。胚胎期、胎兒期、產(chǎn)后生長(zhǎng)發(fā)育期,第二節(jié) 發(fā)育毒性和致畸性

7、,發(fā)育毒性的表現(xiàn),（1）生長(zhǎng)遲緩（2）致畸作用,發(fā)育毒性的表現(xiàn),（3）功能不全或異常,肝、腎、心功能不全。環(huán)境激素類(lèi)物質(zhì)（鄰苯二甲酸酯） ，不僅關(guān)閉了胎兒Y染色體上的Sry基因，并且還轉(zhuǎn)變成了促進(jìn)胚胎出現(xiàn)女性表征的雌性激素。,（4）胚胎或胎仔致死作用 流產(chǎn)、死產(chǎn)或死胎,2．畸形、畸胎和致畸物,畸形(malformation)：器官形態(tài)的異常。畸胎(terate)：致畸物(teratogen)：在一定劑量下，能通過(guò)母體對(duì)

8、胚胎或胎兒正常發(fā)育過(guò)程造成干擾，使子代出生后具有畸形的化合物。,二、致畸作用的毒理學(xué)特點(diǎn),1．器官發(fā)生期的胚胎對(duì)致畸物最為敏感,受精卵發(fā)育為成熟個(gè)體的過(guò)程，包括：胚泡形成、著床、器官發(fā)生、胎兒發(fā)育、新生兒發(fā)育。大鼠器官發(fā)生期約為9-17天；小鼠器官發(fā)生期為7.5-16天；家兔為11-20天 ；人為3-12周。,2．劑量-效應(yīng)關(guān)系較為復(fù)雜,劑量增加，毒性作用增強(qiáng)，但與致畸性不成一定的比例。 胚胎致死作用增強(qiáng)，致畸作用降低。某

9、種致畸物可以引起一定的畸形，但在給予更高的劑量，并不出現(xiàn)同一類(lèi)型的畸形。 例如環(huán)磷酰胺：低劑量——多趾，中等劑量——肢長(zhǎng)骨縮短，高劑量——缺肢或無(wú)肢。許多致畸物除具有致畸作用外，還可能同時(shí)出現(xiàn)胚胎死亡和生長(zhǎng)遲緩，不同表現(xiàn)相互影響，又無(wú)一定規(guī)律。,3．物種差異以及個(gè)體差異在致畸作用中為較為明顯,同一種致畸物對(duì)不同的動(dòng)物并不一定都具有致畸作用，并且引起畸形的類(lèi)型也不一致。 例如：反應(yīng)停對(duì)人類(lèi)以及其它靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物具有強(qiáng)烈致畸作

10、用，但對(duì)小鼠和家兔即使接觸較大劑量，其致畸作用仍極為輕微。同一物種動(dòng)物的不同品系對(duì)一種致畸物敏感性的差別很大。 例如：口服反應(yīng)停，個(gè)體差異較大。,三、致畸作用機(jī)理（了解）,干擾基因表達(dá)基因突變與染色體畸變損傷細(xì)胞和分子水平的翻譯細(xì)胞調(diào)亡干擾細(xì)胞通過(guò)胎盤(pán)毒性引起發(fā)育毒性干擾母體穩(wěn)態(tài)內(nèi)分泌干擾作用,四、外源化學(xué)物發(fā)育毒性的評(píng)價(jià),1．傳統(tǒng)致畸試驗(yàn),動(dòng)物選擇劑量分組動(dòng)物交配處理胎仔檢查數(shù)據(jù)處理結(jié)果評(píng)定,（1）動(dòng)物

11、選擇食性和對(duì)受試物代謝過(guò)程與人類(lèi)接近；體型小，馴服，容易飼養(yǎng)、繁殖及價(jià)廉；妊娠過(guò)程較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多、胎盤(pán)構(gòu)造及厚度與人類(lèi)接近。 大鼠（12-20只/組）,1．傳統(tǒng)致畸試驗(yàn),1．傳統(tǒng)致畸試驗(yàn),（2）劑量分組先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，找出引起母體中毒的劑量；最高劑量組，可以引起母體輕度中毒，即進(jìn)食量減少、體重減輕、死亡不超過(guò)10%；最低劑量組不應(yīng)觀(guān)察到任何中毒癥狀；中間劑量組可以允許母體出現(xiàn)某些極輕微中毒癥狀。,1．

12、傳統(tǒng)致畸試驗(yàn),（3）動(dòng)物交配處理將性成熟雌雄動(dòng)物按雌雄l：1或2：1比例同籠交配。每日將已確定受孕雌鼠隨機(jī)分入各劑量組和對(duì)照組。 受孕日確定由于致畸作用有極為明確的敏感期，應(yīng)精確掌握動(dòng)物接觸受試物的時(shí)間，必須在器官發(fā)生期。,1．傳統(tǒng)致畸試驗(yàn),（4）胎仔檢查自然分娩前1-2日將受孕動(dòng)物處死，剖腹取出活產(chǎn)胎仔（畸形檢查只限活產(chǎn)胎仔）。外觀(guān)畸形肉眼檢查，例如露腦；肉眼檢查內(nèi)臟及軟組織畸形，例如腭裂；

13、骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損， 分叉肋等。,1．傳統(tǒng)致畸試驗(yàn),（5）數(shù)據(jù)處理活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)畸形出現(xiàn)率 母體畸胎出現(xiàn)率致畸指數(shù)= 雌鼠LD50/最小致畸劑量,觀(guān)察指標(biāo),1．傳統(tǒng)致畸試驗(yàn),致畸性大?。褐禄笖?shù) 10以下為不致畸 10-100致畸 100以上強(qiáng)致畸,（6）結(jié)果評(píng)定是否具有致畸性：活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)畸形出現(xiàn)率 母體畸胎出現(xiàn)率,2．發(fā)育毒性

14、的替代試驗(yàn)（了解）,大鼠全胚胎培養(yǎng)胚胎細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)育毒性的體內(nèi)預(yù)篩試驗(yàn)(C .K.試驗(yàn)),一、生殖毒性,包括：生殖細(xì)胞的發(fā)生、配子的釋放、卵細(xì)胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳過(guò)程。,外源化學(xué)物對(duì)生殖過(guò)程的損害作用，即生殖毒性（reproductive toxicity）。,第三節(jié) 生殖毒性及其評(píng)定,生殖毒性的表現(xiàn),性淡漠、性無(wú)能或各種形式的性功能減退。,雌性 排卵規(guī)律改變、經(jīng)期失調(diào)或閉經(jīng)、卵巢萎縮、生

15、殖能力的降低、受孕減少或不孕、胚胎死亡等。雄性 睪丸萎縮或壞死、精子數(shù)目減少。,,,一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)顯示，目前，我國(guó)有育齡夫婦約2.3億人，其中有近1000萬(wàn)不孕不育癥患者，而且每年以數(shù)十萬(wàn)的速度遞增。也就是說(shuō)，我國(guó)每10對(duì)育齡夫婦中就有1對(duì)遭遇生育問(wèn)題，比30年前翻了10倍多！自發(fā)流產(chǎn)率可達(dá)全部妊娠中的50%。著床后的自發(fā)流產(chǎn)率為32%～34%。,2008年，解放軍174醫(yī)院生殖中心調(diào)查顯示，四成男性精子數(shù)量、質(zhì)量不正常。我國(guó)人

16、口和計(jì)劃生育委員會(huì)科學(xué)技術(shù)研究所，整理分析了北京、上海等39個(gè)市、縣的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，近25年來(lái)，我國(guó)男性的精液質(zhì)量正以每年1%的速度下降，精子數(shù)量降幅達(dá)40%以上；且工業(yè)化程度越高，該地區(qū)的精子質(zhì)量降低越明顯。 精子質(zhì)量降低已經(jīng)有低齡化的趨勢(shì)。2009年，武漢一家計(jì)生研究所曾經(jīng)在高校公開(kāi)征精，但意外的是，前來(lái)捐精的400名大學(xué)生志愿者，精子合格的不到50人。,2004年，全國(guó)人大代表鐘南山院士在廣州分組討論會(huì)上說(shuō)：“食品安全日趨嚴(yán)重

17、，50年后廣東的大多數(shù)人將喪失生育能力?！鄙C(jī)，隨科技進(jìn)步和化學(xué)革命已經(jīng)降臨到人類(lèi)頭上的。食品安全已成為破壞男女生育能力的禍?zhǔn)?。?duì)于直接和間接用于食品的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)是一項(xiàng)極為重要的任務(wù)。,1．精子的形成,精原細(xì)胞(休止?fàn)顟B(tài)) 2n 有絲分裂(青春期)初級(jí)精母細(xì)胞 2n 減數(shù)分裂次級(jí)精母細(xì)胞 n 精細(xì)胞 n,精細(xì)胞轉(zhuǎn)變成成

18、熟精子精子生成或精子發(fā)生,,,,,人：72-90天小鼠：35天大鼠：48天兔：43天,二、雄性生殖毒性評(píng)價(jià),2．毒物對(duì)雄性生殖的影響,對(duì)睪丸生精細(xì)胞的影響 精子生成障礙、引起生殖細(xì)胞突變。對(duì)內(nèi)分泌功能的影響 睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能異常，有關(guān)激素合成或作用 發(fā)生改變。,3．雄性生殖毒性的檢測(cè)方法,（1）精子生成分析精子計(jì)數(shù)精子形態(tài)觀(guān)測(cè)精子狀態(tài)分析試驗(yàn)（2）精子穿透試驗(yàn)檢測(cè)精子在體外能否成功穿

19、透去透明帶的金黃地鼠卵子而受精的試驗(yàn)。,（3）體外試驗(yàn)睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)。 （4）睪丸中標(biāo)志酶活性的測(cè)定指標(biāo)：乳酸脫氫酶X、山梨醇脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶；（5）雄性激素檢測(cè)指標(biāo)：促性腺激素、黃體生成素、雄激素的含量,正常細(xì)胞電泳圖,受損細(xì)胞電泳圖,（6）雄性生殖細(xì)胞的遺傳毒性試驗(yàn) ——單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（彗星試驗(yàn)）,（7）病理學(xué)檢查大體檢查：睪丸、附睪、前列腺及精囊的重量和形態(tài)；病理組織

20、學(xué)檢查,L：隱睪鼠的睪丸和附睪 R：正常鼠的睪丸和附睪,A ：正常雄性仔鼠的睪丸和附睪; B ：尿道下裂仔鼠的睪丸和附睪。 (×200）,三、雌性生殖毒性評(píng)價(jià),1．雌性生殖細(xì)胞的生成過(guò)程,卵原細(xì)胞(休止?fàn)顟B(tài)) 2n 有絲分裂(青春期)初級(jí)卵母細(xì)胞 2n 減數(shù)分裂次級(jí)卵母細(xì)胞 n 減數(shù)分裂 卵細(xì)胞 n

21、成熟卵子,,,,,2．毒物對(duì)雌性生殖系統(tǒng)的影響,對(duì)卵細(xì)胞的影響 卵母細(xì)胞數(shù)減少或突變對(duì)內(nèi)分泌功能的影響 影響受精、著床、胚胎發(fā)育、分娩等其它毒性作用 如對(duì)子代造成畸形、死胎、功能發(fā)育不全等。,生精細(xì)胞,3．雌性生殖毒性的檢測(cè)方法,雌性生殖毒性的檢測(cè)方法,,動(dòng)物試驗(yàn),體外試驗(yàn),其他輔助試驗(yàn),,繁殖毒性試驗(yàn)和致畸試驗(yàn),三段生殖試驗(yàn),,妊娠前期及初期,器官形成期,圍產(chǎn)期及授乳期,四、生殖毒性的評(píng)價(jià),繁殖毒性試驗(yàn)

22、作用：全面反映外源化學(xué)物對(duì)性腺功能、交配行為、受孕、妊娠過(guò)程、分娩、授乳以及幼仔斷乳后生長(zhǎng)發(fā)育可能發(fā)生的影響。,1．繁殖毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì),動(dòng)物選擇：多用性成熟大鼠， 雌雄比例1:1或2:1。染毒：接觸受試物的方式可混入飼料或飲水中，由動(dòng)物攝取，也可采用灌胃或腹腔注射。劑量分組：設(shè)三個(gè)劑量組，以及一個(gè)空白和溶劑對(duì)照組。 高劑量組：以超過(guò)人類(lèi)實(shí)際接觸水平，能使新一代動(dòng)物出現(xiàn)輕度中毒，死亡率不超過(guò)10%，不完全喪失生育能力。 低劑