apoptosis

1、細(xì)胞死亡,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系,概述,細(xì)胞死亡是生命體的重要生命活動(dòng)之一；細(xì)胞的死亡與新生之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于維持組織和器官的正常功能、保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡和穩(wěn)定具有重要作用；細(xì)胞死亡調(diào)控的異?？蓪?dǎo)致腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病等多種疾病的發(fā)生。,,概述,根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，三種重要的細(xì)胞死亡方式：apoptosis/凋亡autophagic cell death/自噬性細(xì)胞死亡necrosis/壞死,,Th

2、e Nomenclature Committee on Cell Death (NCCD)Cell Death and Differentiation (2009) 16, 3–11,細(xì)胞凋亡Apoptosis,細(xì)胞凋亡概念的形成,1972年Kerr和Wyllie正式提出細(xì)胞凋亡 （apoptosis） 的概念 apoptosis源于希臘語(yǔ)，apo意為from， ptosis意為fall，用于描述花兒凋謝、樹(shù)葉落下的自然景色。這里

3、用來(lái)描述以染色質(zhì)凝聚、核固縮、細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜發(fā)泡等為特征的細(xì)胞死亡。 (Br J Cancer. 26: 239–257, 1972),,細(xì)胞凋亡概念的形成,細(xì)胞凋亡深入到基因水平的研究起始于秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）Sydney Brenner, John E. Sulst

4、on系統(tǒng)研究了線蟲(chóng)整個(gè)發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞分裂和分化，于1998年完成了線蟲(chóng)的基因組測(cè)序工作。1970-1980年間，美國(guó)科學(xué)家Robert H. Horvitz 研究了線蟲(chóng)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的基因調(diào)控機(jī)制。三位科學(xué)家獲得2002年生理和醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)。,,羅伯特-霍維茨 悉尼-布雷內(nèi) 約翰-蘇爾斯頓,細(xì)胞凋亡的概念,細(xì)胞在凋亡因子的刺激下發(fā)生的一種由基因調(diào)控的、主動(dòng)的程序性死亡；具有獨(dú)特的形態(tài)學(xué)和生物

5、化學(xué)特征,一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征,1. 凋亡的起始階段： 細(xì)胞變圓,偽足收縮； 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核體積縮?。ü炭s，pyknosis）； 細(xì)胞器多無(wú)明顯變化 核染色質(zhì)密度增高,凝聚在核膜周邊（邊緣化），呈新月形。,一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征,2. 凋亡小體的形成：核仁裂解，核染色質(zhì)斷裂，細(xì)胞膜內(nèi)陷將細(xì)胞進(jìn)行分割;細(xì)胞表面產(chǎn)生許多泡狀或芽狀突起（blebbing）;形成單個(gè)的凋亡小體（apoptotic body）。,

6、一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征,3. 凋亡小體被鄰近的細(xì)胞吞噬并消化,NATURE CELL BIOLOGY | VOL 2 | JUNE 2000,E104,,2 細(xì)胞呈現(xiàn)沸騰運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞膜發(fā)泡,3 凋亡小體 形成,5 單核巨噬細(xì)胞吞噬,1 細(xì)胞體積變小，染色質(zhì)凝集，周邊化，呈新月形,4 上皮細(xì)胞吞噬,,,,,一、細(xì)胞凋亡的

7、形態(tài)學(xué)特征,細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征,膜通透性增加；細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器腫脹（線粒體腫脹）；溶酶體破壞；細(xì)胞膜破裂；核染色質(zhì)不規(guī)則位移； 引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)； 成群細(xì)胞丟失； 最終被巨噬細(xì)胞吞噬。,細(xì) 胞 凋 亡 細(xì) 胞 壞 死1.單個(gè)細(xì)胞丟失 細(xì)胞成群丟失2.細(xì)胞膜發(fā)泡但仍完整 細(xì)胞膜不完整3.細(xì)胞膜內(nèi)陷將細(xì)胞 細(xì)胞腫脹、溶解

8、 分割成凋亡小體 4.不發(fā)生炎癥反應(yīng) 發(fā)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)5.被鄰近正常細(xì)胞 被巨噬細(xì)胞所吞噬或吞噬細(xì)胞所吞噬6.溶酶體完整 溶酶體裂解7.染色質(zhì)均一凝集 染色質(zhì)聚集成塊、不均一,,細(xì)胞凋亡與壞死在形態(tài)學(xué)上的差別,,,,,A 壞死細(xì)胞,B 凋亡細(xì)胞,細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死在形態(tài)學(xué)上的區(qū)別,3. SE

9、M of a necrotic cell. Numerous lesions appear on the cell surface.,4. SEM of an apoptotic cell. Surface blebbing is evident.,細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死在形態(tài)學(xué)上的區(qū)別,二、細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)特征,胞膜: 磷脂酰絲氨酸（PS）由膜內(nèi)側(cè)翻到膜外表面,胞質(zhì)：蛋白酶（caspase）活化，發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)（cascade），并伴隨

10、有能量消耗、新基因轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)合成,胞核：細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)DNA被核酸內(nèi)切酶降解；從凋亡細(xì)胞中提取的DNA在瓊脂糖凝膠電泳中呈梯狀 （DNA ladder）,三、細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控分子,caspase家族Bcl-2 家族,三、細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控分子,線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans) 為細(xì)胞凋亡的研究作出了巨大貢獻(xiàn)。 線蟲(chóng)在發(fā)育過(guò)程中，共產(chǎn)生1090個(gè)細(xì)胞，其中131個(gè)細(xì)胞發(fā)生凋亡。,三、細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控分子,線

11、蟲(chóng)中有11個(gè)基因與細(xì)胞凋亡相關(guān)，其中ced3 （cell death abnormal）和ced4基因是促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因抑制細(xì)胞凋亡。突變體ced3: 所有的 131 個(gè)細(xì)胞存活ced4: 所有的 131 個(gè)細(xì)胞存活ced9: 在胚胎發(fā)生過(guò)程中所有的細(xì)胞死亡哺乳動(dòng)物中 ICE（interleukin-1 β converting enzyme, 即caspase-1）， 為ced3的同源蛋白,caspase家族,半

12、胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteinyl aspartate-specific proteinase，caspase），其活性部位均含有半胱氨酸殘基，其切割位點(diǎn)為底物的天門(mén)冬氨酸殘基后的肽鍵。,哺乳動(dòng)物中15種同源分子，其中7種參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。根據(jù)其激活 方式及在細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞中的作用，分為： 凋亡起始酶（ initiator caspase ）：,caspase－2，8， 9，10。,凋亡效應(yīng)酶（ effector ca

13、spase ）：,caspase－3，6，7。,caspase家族,caspase家族,體內(nèi)的存在形式：以胱天蛋白酶原（zymogen）的形式合成，呈低水平組成性表達(dá)。酶原主要由原結(jié)構(gòu)域 (prodomain)、大亞單位(p20) 和小亞單位(p10)組成。,caspase家族,DED, death effector domain ; CARD, caspase recruitment domain,caspase的活化,同源活化（

14、homo-activation）/自身活化（self-activation）：起始酶（initiators）的活化起始酶含有較長(zhǎng)的原結(jié)構(gòu)域，對(duì)其活性有抑制作用通過(guò)DED、CARD結(jié)構(gòu)域與其它蛋白質(zhì)相互作用形成二聚體/寡聚體而恢復(fù)酶活性,caspase的活化,caspase的活化,異源活化（hetero-activation）：活化的起始酶催化水解效應(yīng)酶將凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)放大caspase cascade,caspase的活化,cas

15、pase的效應(yīng)機(jī)制,效應(yīng)性caspase可裂解多種底物蛋白：多種蛋白激酶，如FAK (focal adhesion kinase)等。FAK的降解可使細(xì)胞喪失粘附能力，形成游離細(xì)胞核纖層蛋白，導(dǎo)致核纖層的解組裝和核的皺縮細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白，如微絲、中等纖維等，使細(xì)胞變形,caspase的效應(yīng)機(jī)制,效應(yīng)性caspase可裂解多種底物蛋白：激活核酸酶，caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyr

16、ibonulease，CAD）正?；罴?xì)胞核酸酶CAD與其抑制物ICAD結(jié)合在一起處于無(wú)活性狀態(tài)caspase可以裂解其抑制物ICAD而激活核酸酶CAD,caspase的效應(yīng)機(jī)制,caspase的效應(yīng)機(jī)制,效應(yīng)性caspase可裂解多種底物蛋白： DNA修復(fù)酶，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（poly (ADP-ribose) polymerase, PARP）鈣不依賴的磷脂酶A2 （iPLA2），生成溶血磷脂酰膽堿 （ LPC），

17、招募單核細(xì)胞,Bcl-2（B cell leukemia 2）是一種原癌基因； 定位于線粒體外膜，可與胞質(zhì)蛋白或同時(shí)錨定在線粒體外膜的該家族的其它蛋白相互作用；促進(jìn)細(xì)胞存活（survival），抑制細(xì)胞凋亡，而不是促進(jìn)細(xì)胞增殖（proliferation）。,Bcl-2家族,所有Bcl-2家族成員均含有1～4個(gè)保守的BCL-2同源結(jié)構(gòu)域(BCL-2 homologue, BH)，稱為BH1 ～ BH4。根據(jù)對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)功能的不

18、同，將Bcl-2家族成員分為兩類(lèi)：抗凋亡的負(fù)調(diào)節(jié)因子；促進(jìn)細(xì)胞凋亡的正調(diào)節(jié)因子,Bcl-2家族,Bcl-2家族的分類(lèi)，Tait and Green, 2010,Bcl-2亞家族： Bcl-2、 Bcl-xl、 Bcl-w、Mcl-1、A1，具有BH1、BH2、BH3和BH4四個(gè)結(jié)構(gòu)域。定位于線粒體外膜，抑制細(xì)胞凋亡Bax亞家族：Bax、Bak、Bok，具有BH1、BH2、BH3三個(gè)結(jié)構(gòu)域，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)分子。需轉(zhuǎn)位到線粒體外

19、膜BH3亞家族：Bad、Bid、Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml，僅有BH3結(jié)構(gòu)域，通過(guò)與抗凋亡的核心分子結(jié)合，而釋放BAX、BAK等，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡,Bcl-2家族,BAX、BAK的活化是線粒體外膜通透化（MOMP）的關(guān)鍵，BH3亞家族蛋白被誘導(dǎo)表達(dá)或激活后，可與BCL-2家族的抗凋亡核心蛋白質(zhì)結(jié)合，從而解放出BAX、BAK，或者通過(guò)直接作用于BAX、BAK，調(diào)控其活化，使其寡聚化，形成蛋白質(zhì)孔道，引起MOMP，促

20、進(jìn)細(xì)胞色素Ｃ的釋放，激活caspase cascade，促進(jìn)凋亡。,Bcl-2家族,四、細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路,細(xì)胞凋亡的外在途徑（extrinsic pathway ）/死亡受體通路 由細(xì)胞膜上的死亡受體接受外環(huán)境中的死亡信號(hào)并迅速激活胞內(nèi)胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使凋亡信號(hào)放大并傳遍整個(gè)細(xì)胞，引起凋亡效應(yīng)。,死亡受體（ Death Receptor）,屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族其中研究最充分的是FasL/FasR和

21、 TNF-α/TNFR-1系統(tǒng)。,,死亡受體（ Death Receptor）,一種跨膜蛋白，包含一個(gè)富含半胱氨酸殘基的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)胞內(nèi)的由約80個(gè)氨基酸殘基組成的死亡結(jié)構(gòu)域 （death domain, DD）；死亡結(jié)構(gòu)域可與具有死亡結(jié)構(gòu)域同源序列的蛋白質(zhì)結(jié)合，在細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳遞中起至關(guān)重要的作用。,Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞途徑,DED, death effector domain

22、 死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域,FADD, Fas-associated death domain, Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白,DD, death domain, 死亡結(jié)構(gòu)域,死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（ DISC）,FasR招募的FADD一方面通過(guò)其C端的DD結(jié)構(gòu)域與死亡受體相互作用，另一方面又可通過(guò)其N(xiāo)端的DED結(jié)構(gòu)域與procaspase-8/procaspase-10分子N端的DED結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成死亡受體-接頭蛋白

23、-procaspase-8/10組成的復(fù)合物，即死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體 (death-inducing signal complex, DISC)，引發(fā)procaspase-8/procaspase-10的二聚化，發(fā)生自我剪切而活化。,,2. 細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑（ intrinsic pathway）/線粒體通路 /應(yīng)激通路 射線、化學(xué)物質(zhì)等造成DNA損傷，氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白累積等應(yīng)激因素，通過(guò)活化凋亡調(diào)節(jié)蛋白直接或間接地影響

24、線粒體膜的通透性，而使線粒體釋放一些細(xì)胞凋亡相關(guān)分子，并啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡的過(guò)程。,四、細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路,細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑,凋亡信號(hào)刺激細(xì)胞引起：跨膜電位（△φ）下降；線粒體膜通透性（ mitochondrial membrane permeability, MMP）增加；膜孔變大，導(dǎo)致線粒體內(nèi)的電子載體蛋白細(xì)胞色素C（CytC）釋放。,細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑,CytC胞質(zhì)中的Apaf-1因子（細(xì)胞凋亡蛋

25、白酶激活因子1，apoptotic protease activating factor 1）脫氧三磷酸腺苷多個(gè)Procaspase-9 形成一個(gè)活化的凋亡體（apoptosome)。,細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑,凋亡體使procaspase-9被水解形成有活性的caspase-9，再進(jìn)一步活化下游的效應(yīng)性caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并水解相應(yīng)的底物，引發(fā)細(xì)胞凋亡。,細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑,p53是腫瘤抑制基因，其產(chǎn)物主要存在于細(xì)胞核

26、內(nèi)；在依賴p53蛋白的細(xì)胞凋亡中，p53通過(guò)特異性抑制Bc1-2的表達(dá)，促進(jìn)Bax的表達(dá)，使Bc1-2 / Bax 蛋白比例失調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。,p53對(duì)內(nèi)在途徑的調(diào)節(jié),Death Receptor pathway,五、凋亡細(xì)胞的檢測(cè),1. 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)2. DNA片段化3. 細(xì)胞膜的改變4. 線粒體分析5. caspase活性及其底物的生化分析,五、凋亡細(xì)胞的檢測(cè),細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè) 電鏡： 免疫熒光

27、：,五、凋亡細(xì)胞的檢測(cè),2. DNA片段化：細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)DNA被核酸內(nèi)切酶降解; 從凋亡細(xì)胞中提取的DNA在瓊脂糖凝膠電泳中呈梯狀（DNA ladder）。,五、凋亡細(xì)胞的檢測(cè),2. DNA片段化 TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick End Labeling）：基因組DNA斷裂時(shí)，暴露的3’末端可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）

28、 的催化下加上熒光素（FITC）標(biāo)記的dUTP （ FITC-dUTP），從而可以通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。,原位TUNEL染色,（Terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP Nick End Labeling） 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法,對(duì)照組

29、 實(shí)驗(yàn)組,Ca+,磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，凋亡時(shí)，可從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35?36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。,五、凋亡細(xì)胞的檢測(cè),3. 細(xì)胞膜的改變,FITC-Annexin-V-Fluorescence,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PS外翻,,,,,PI Fluoresc

30、ence,五、凋亡細(xì)胞的檢測(cè),4. 線粒體分析 正常細(xì)胞：線粒體跨膜電位存在， 親脂性陽(yáng)離子熒光燃料：Rhodamine 123等結(jié)合到線粒體，染料聚集，表現(xiàn)出特有的熒光； 凋亡細(xì)胞：染料彌散在細(xì)胞質(zhì)中,五、凋亡細(xì)胞的檢測(cè),5. caspase活性及其底物的生化分析： Western blot 免疫沉淀 免疫組化 對(duì)PARP底物的剪切 利用熒光標(biāo)記的底物檢測(cè)caspase的活性,

31、caspase活性的檢測(cè),正常：caspase-3以酶原（32KD）形式存在于胞漿，凋亡早期：被激活，其活性形式由兩個(gè)大亞單位和兩個(gè)小亞單位組成。,六、 細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義,確保正常個(gè)體發(fā)育維持組織、器官功能保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，清除機(jī)體內(nèi)不需要的結(jié)構(gòu),六、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義,蝌蚪變成青蛙的過(guò)程中尾巴的消失,六、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義,人手的發(fā)育過(guò)程伴隨著細(xì)胞的凋亡 個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，組織結(jié)構(gòu)的塑造,六、細(xì)胞凋亡的生物

32、學(xué)意義,調(diào)控細(xì)胞的數(shù)目 ：大鼠視覺(jué)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中，清除神經(jīng)軸突出現(xiàn)錯(cuò)誤連接的細(xì)胞,六、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義,清除機(jī)體不再需要的細(xì)胞： 月經(jīng)期子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的清除,清除對(duì)機(jī)體有害的細(xì)胞： 消除識(shí)別并可攻擊自身組織的表達(dá)不成熟的T淋巴細(xì)胞抗原受體的胸腺細(xì)胞,六、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義,成年人體內(nèi)細(xì)胞的增殖和死亡處于動(dòng)態(tài)平衡,維持機(jī)體組織器官中細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定,六、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義,腫瘤自身免疫性疾病,神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病病毒感

33、染性疾病，如艾滋?。ˋIDS）心血管系統(tǒng)的疾病等,細(xì)胞自噬與死亡Autophagy & Autophagic cell death,Autophagy 自噬,泛指胞質(zhì)中一些需降解的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等成分被運(yùn)送到溶酶體被消化降解的細(xì)胞代謝過(guò)程；清除細(xì)胞中多余的、損傷的或衰老的細(xì)胞器以及變性蛋白質(zhì)與核酸等生物大分子；

34、 Nature Cell Biology 12 , 2010: 817,Autophagy 自噬,真核細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)、實(shí)現(xiàn)更新的一種重要的進(jìn)化保守機(jī)制；一種重要的防御和保護(hù)機(jī)制，在個(gè)體生長(zhǎng)、發(fā)育、人類(lèi)疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

35、 Nature Cell Biology 12 , 2010: 817,Autophagy 自噬,分類(lèi)：巨自噬（macroautophagy）分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaperone-mediated autophagy）微自噬（microautophagy）,Chaperone-mediated autophagy,Autophagy 自噬,Nature Cell Biology 12 ,2010: 823,,,a

36、 Nucleation/Assembly成核/組裝,b Membrane elongation膜延長(zhǎng),d Fusion 融合自噬性溶酶體,e Degradation 降解,Nature Cell Biology 9 ,2007.1102-1109,c Autophagosome自噬體,Schematic depiction of autophagy.,Nature， 2007 , 8 :742,自噬相關(guān)基因 ，AuTophaG

37、y-related ，Atg,LC3-I,LC3-II,自噬性細(xì)胞死亡 Autophagic cell death,Cell Death and Differentiation (2009) 16, 3–11,由自噬介導(dǎo)的、因細(xì)胞中自噬流增強(qiáng)而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡；細(xì)胞質(zhì)中包含許多自噬性溶酶體和一些自噬體；可以被作用在自噬通路的抑制劑所阻抑。,重點(diǎn)掌握內(nèi)容,細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)特征 細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控分子 caspase