torch檢測(cè)方法 ppt課件

1、TORCH感染檢測(cè)方法與結(jié)果分析,,1971 年Nahmias 等首先描述了病原體感染對(duì)胎兒的致畸作用，他將數(shù)種能引起孕期宮內(nèi)感染，甚至造成先天缺陷或發(fā)育異常的病原體英文名詞的第一個(gè)字母組合而成“TORCH”，即弓形蟲(chóng) ( TOX) 、風(fēng)疹病毒(RV) 、巨細(xì)胞病毒(CMV) 、單純皰疹病毒(HSV)、其他(OTH)。其他病原體感染包括細(xì)小病毒（B19）、沙眼衣原體（CT）、解脲支原體（UU）等。近幾年人乳頭瘤病毒（HPV）、淋球菌（

2、GC）感染率明顯上升，也引起學(xué)者重視。,孕期TORCH感染通常無(wú)癥狀，但對(duì)胎兒可造成危害，可導(dǎo)致自然流產(chǎn)、胎兒畸形、死胎、胎兒生長(zhǎng)受限（FGR）、早產(chǎn)及新生兒疾病等嚴(yán)重并發(fā)癥。雖然TORCH感染對(duì)胎兒、新生兒能夠產(chǎn)生不利影響，但經(jīng)積極治療后再次受孕仍可分娩正常嬰兒。因此在孕前監(jiān)測(cè)TORCH 感染，爭(zhēng)取在孕前進(jìn)行干預(yù)，選擇適宜的妊娠時(shí)機(jī)受孕，可減少不良妊娠結(jié)局的發(fā)生，對(duì)減少先天性感染兒及病殘兒的出生極為重要。,TORCH

3、感染臨床檢測(cè)最常用的方法包括兩種： TORCH抗體的檢測(cè) TORCH病原體的檢測(cè),一、TORCH抗體檢測(cè)方法與結(jié)果分析 1、檢測(cè)方法 用于測(cè)定液體標(biāo)本中的微量物質(zhì)，最常用的是免疫標(biāo)記技術(shù)，是指用熒光素、酶、放射性同位素、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原后進(jìn)行的抗原抗體的反應(yīng)。這類檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是特異、靈敏、快速、能夠定性和定量、易于觀察結(jié)果等。我們實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)TORCH抗體采用的方法是酶免疫測(cè)定

4、中的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），它是用酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。,（1）標(biāo)本采集和處理 病人無(wú)需空腹，通過(guò)無(wú)菌性靜脈穿刺采集自凝血樣本2ml，離心后留取血清，最好是新鮮血清用于測(cè)定，如不能立即測(cè)定可保存于-20℃，不能反復(fù)凍融。溶血、高脂血癥、黃疸可能影響檢測(cè)結(jié)果。,,（2）檢測(cè)原理 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是根據(jù)酶免疫測(cè)定原理發(fā)展的一種固相免疫酶技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的檢測(cè)。ELISA的

5、基本原理是：①抗原和抗體能與固相載體表面結(jié)合并保持其免疫活性；②抗原和抗體與酶結(jié)合成的標(biāo)記物，既能保持抗原或抗體的免疫活性，又能保持酶的活性；③受檢物中的抗原或抗體與固相表面的抗體或抗原發(fā)生免疫反應(yīng)并結(jié)合在固相表面，此抗原抗體復(fù)合物又能結(jié)合相應(yīng)的酶標(biāo)記物 ,,用洗滌方法除去未結(jié)合而游離的酶標(biāo)記物，繼而加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化為有色產(chǎn)物，顯色的程度與受檢物中的抗原或抗體的量直接相關(guān)，用合適的分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀進(jìn)行比色，根據(jù)顏色反應(yīng)

6、的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，一般1分子酶在1min內(nèi)可催化數(shù)十萬(wàn)乃至上千萬(wàn)分子底物變?yōu)楫a(chǎn)物，故可極大地放大反應(yīng)結(jié)果，從而使測(cè)定方法具有很高的敏感度。,我們實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗體的具體步驟是:先將已知的可溶性抗原吸附于某一種固相載體表面，并保持其免疫活性。加入待檢血清，患者血清與固相載體表面的抗原接觸起反應(yīng)，如血清中有相應(yīng)特異性抗體存在，則抗體會(huì)與抗原結(jié)合在固相載體上，形成抗原—抗體復(fù)合物，洗滌去除過(guò)多的抗體。然后加入用辣根過(guò)

7、氧化物酶標(biāo)記的抗體復(fù)合物，后者將會(huì)與抗原—抗體復(fù)合物結(jié)合。,通過(guò)洗滌，洗去未反應(yīng)的酶標(biāo)記抗體，這樣結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）后，底物經(jīng)酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，用酶標(biāo)儀進(jìn)行比色，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性分析。,,,2、結(jié)果分析 抗體中的IgM和IgG以高濃度遍布全身，是全身性體液免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)分子。IgM是初次體液免疫應(yīng)答早期

8、階段產(chǎn)生的主要免疫球蛋白，主要分布于血液中，抗全身感染的作用較強(qiáng)。IgG是再次體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要免疫球蛋白，在血漿和組織液中各占50%左右，故幾乎分布于全身各組織及體液中。IgG是唯一能通過(guò)胎盤的免疫球蛋白，故對(duì)新生兒抗感染起重要作用。,TORCH感染后，一般首先出現(xiàn)的是IgM，然后才產(chǎn)生IgG，感染后5～6天IgM＞IgG，20～30天IgM達(dá)到高峰。感染后4～8周IgG達(dá)到高峰，并維持多年至終生。,抗體實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋參考表：,,,

9、,,,IgM IgG 結(jié) 果 解 釋,－ － 從未感染過(guò)。易感人群,＋ － 兩周后復(fù)查，結(jié)果相同， 考慮為近期感染,－ ＋ 遠(yuǎn)期感染過(guò)，近期無(wú)感染,＋ ＋ 原發(fā)性感染或再感染,,,,,,,孕婦血清中IgM 陽(yáng)性是診斷活動(dòng)性感染重要而可靠的指標(biāo)，但由于它實(shí)際檢測(cè)

10、的是人體對(duì)TORCH感染的免疫反應(yīng)狀態(tài)，因此對(duì)那些處于潛伏狀態(tài)不排毒的孕婦，或免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的孕婦，易出現(xiàn)漏檢。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，根據(jù)檢測(cè)病原體DNA 或RNA 的水平對(duì)感染進(jìn)行診斷就更為直接，并越來(lái)越受到圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。 TORCH抗體的檢測(cè)一般用于孕前和孕早期病原體感染的篩查，IgM陽(yáng)性婦女需進(jìn)一步作病原體DNA或RNA檢測(cè)以明確感染的存在。,二、TORCH病原體的檢測(cè)方法與結(jié)果分析

11、 1、檢測(cè)方法 檢測(cè)TORCH病原體，臨床常用方法是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），又稱體外酶促基因擴(kuò)增法。 （1）標(biāo)本采集 TOX采集EDTA防凝血2ml，利用低滲法提取白細(xì)胞；RV、CMV采取自凝血，離心提取血清；HSV、CT、UU、NG、HPV等采取宮頸分泌物。,,（2）技術(shù)原理 PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合

12、酶的酶促合成反應(yīng)。PCR由高溫變性—低溫退火—中溫延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：① 模板DNA的變性：通過(guò)加熱使模板DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離成單鏈，以便它與引物結(jié)合；② 模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。,當(dāng)溫度突然降低時(shí)由于模板DNA的分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜的多，而且反應(yīng)體系中引物DNA的量大大多于模板DNA，使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA之間互補(bǔ)的機(jī)會(huì)較少。③ 引物的延伸：

13、在DNA聚合酶和四種脫氧核糖三磷酸底物及Mg2存在的條件下，模板-引物結(jié)合物，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。以上三步為一循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板。這樣反復(fù)循環(huán)以上反應(yīng)過(guò)程就能將待測(cè)目的基因數(shù)量呈指數(shù)倍數(shù)擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。,PCR產(chǎn)物可用凝膠電泳分析法分析結(jié)果。常用的是瓊脂糖凝膠電泳，在配制瓊脂糖時(shí)加入0.5μg/ml的溴化乙錠（EB），或在電泳后凝膠用電泳緩沖液配制的同樣濃度的EB液染色15-30mi

14、n，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照記錄。,,,,,我們實(shí)驗(yàn)室采用的是實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，常規(guī)PCR存在著不能定量和產(chǎn)物污染假陽(yáng)性等問(wèn)題，使其臨床應(yīng)用受到限制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR就是利用熒光信號(hào)檢測(cè)整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程，獲得在線描述PCR過(guò)程動(dòng)力學(xué)曲線。其原理是在常規(guī)PCR擴(kuò)增體系中，加入一個(gè)與靶基因序列特異互補(bǔ)的雙熒光標(biāo)記探針。探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，由于淬滅基團(tuán)的淬滅作用，熒光報(bào)告基團(tuán)不能產(chǎn)生熒光

15、發(fā)射。,當(dāng)有靶基因存在時(shí)，在PCR的復(fù)性延伸期，標(biāo)記探針即與靶基因互補(bǔ)結(jié)合，新合成鏈從引物開(kāi)始，沿膜板延伸，當(dāng)新鏈延伸至標(biāo)記探針結(jié)合部時(shí)，DNA聚合酶具有5’—3’的外切酶活性，將探針5’端熒光報(bào)告基團(tuán)切下。從而，熒光報(bào)告基團(tuán)淬滅作用被解除，產(chǎn)生熒光發(fā)射。通過(guò)熒光光譜分析儀連續(xù)不斷地檢測(cè)反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)的變化。,其定量原理是：首先根據(jù)PCR擴(kuò)增過(guò)程中，產(chǎn)物信號(hào)（熒光）尚未出現(xiàn)前本底熒光信號(hào)平均值加3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差確定為熒光閾值。在PCR反

16、應(yīng)中設(shè)置原始已知定量膜板管進(jìn)行擴(kuò)增，這樣不同定量膜板管經(jīng)過(guò)不同循環(huán)次數(shù)達(dá)到熒光閾值，此時(shí)的循環(huán)次數(shù)(Ct值：也稱循環(huán)閾值) 就被記錄下來(lái)。該循環(huán)參數(shù)和PCR 體系中起始DNA量的對(duì)數(shù)值之間有嚴(yán)格的線性關(guān)系，根據(jù)循環(huán)參數(shù)Ct 值就可以準(zhǔn)確計(jì)算出起始DNA的數(shù)量。即能得出待測(cè)樣品原始膜板的數(shù)量，從而實(shí)現(xiàn)樣品膜板的定量。,熒光定量基因擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，克服了假陽(yáng)性的主要來(lái)源，可準(zhǔn)確定量出低至1個(gè)拷貝/微升的病原體，真實(shí)地反映了病人體內(nèi)