精液冷凍概述課件

1、精液冷凍技術(shù)概述,四川大學(xué)華西第二醫(yī)院人類精子庫,2,精液冷凍歷史回顧,1776年Spallanzani偶然發(fā)現(xiàn)將人精液埋藏于冰雪仍可存活1886年Mantegazza發(fā)現(xiàn)在－15℃下的精子可以存活較長時(shí)間；     1937年Jannel報(bào)告人類精子可在-196℃中存活；     1949年P(guān)olge首先發(fā)現(xiàn)甘油對冷凍精子具有特殊保護(hù)作用。,

2、3,冷凍精液的臨床意義,供者人工授精（AID）使用方便，并且可以配合女性生殖周期進(jìn)行；對有先天遺傳疾病和嚴(yán)重傳染性疾病的患者可以使用；進(jìn)行生殖保險(xiǎn)；如男性絕育手術(shù)者，腫瘤患者化療前，從事危險(xiǎn)行業(yè)者等；對于少、弱精癥者，可多次采集冷凍后加以濃縮；對于取精困難和梗阻性無精癥的患者在ICSI治療時(shí)，用凍融精子代替新鮮精子可避免反復(fù)抽吸睪丸或附睪，利于醫(yī)患雙方掌握治療進(jìn)度。,4,冷凍損傷原理,冰晶損傷學(xué)說 ice crystal d

3、amage 溶液效應(yīng)學(xué)說 solute damage,5,冷凍原理,降溫過程分期：溫度休克期RT~5℃潛熱擴(kuò)散期5～0℃ 冰晶形成期0～－15℃再結(jié)晶期－15～－79℃保存期－80～－196℃,6,冷凍損傷原理,精子,示意圖：,精子細(xì)胞外冰晶形成,胞內(nèi)冰晶形成,細(xì)胞脫水,冰晶損傷,溶液損傷,,,,,,降溫,快速,慢速,7,冷凍對精子產(chǎn)生的損傷,超微結(jié)構(gòu)的損傷： 冷凍復(fù)溫后的精

4、子外膜變薄，波浪狀改變或破損，胞漿、頂體內(nèi)和線粒體內(nèi)透光度增加，頂體增寬，線粒體外形變圓，軸絲增粗，提示細(xì)胞腫脹是形態(tài)改變得主要征象。 精子功能： 日本學(xué)者研究根據(jù)精子頂體功能和穿透率無顯著變化，發(fā)現(xiàn)冷凍精子授精能力無下降。染色體： 目前對冷凍保存精子染色體自然畸變率報(bào)道不多，仍存在爭論,8,冷凍保護(hù)原理,冷凍保護(hù)液 滲透性 增加細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，降低細(xì)胞內(nèi)外液的冰點(diǎn)，減少冰晶的形成。

5、 非滲透性 調(diào)節(jié)PH，細(xì)胞外滲透壓，增加營養(yǎng)不同溫區(qū)最適的冷凍速率 研究表明過快或過慢的降溫都是不合適的，應(yīng)根據(jù)不同的冷凍保護(hù)劑選擇各個溫區(qū)最佳的降溫速度。目前還未找到。,9,冷凍保護(hù)劑 （CPM）,根據(jù)CPM的特性： 非滲透性CPM：卵黃、葡萄糖、蔗糖 滲透性CPM：甘油根據(jù)CPM種類 : 單一甘油型 復(fù)合甘油型 無甘油型,10,冷凍保護(hù)劑 （CPM）,各成分的主要作用 :甘

6、油：有滲透性，當(dāng)進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)時(shí)使精子內(nèi)的含水蛋白質(zhì)穩(wěn)定，降低細(xì)胞內(nèi)液冰點(diǎn)，減少冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。但甘油本身對細(xì)胞也有一定的毒性，一般終濃度控制在7～10％。 卵黃：提高細(xì)胞外滲透壓，含有卵磷脂，可以穩(wěn)定精子的細(xì)胞膜，防止頂體外膜破裂。它的缺點(diǎn)是凍融后有大量的顆粒和碎片，并且有病毒感染和過敏反應(yīng)當(dāng)可能。,11,冷凍保護(hù)劑 （CPM）,各成分的主要作用 :葡萄糖：與調(diào)節(jié)滲透壓有關(guān) 緩沖系統(tǒng)：可以結(jié)合游離的H+和

7、OH－，有助于溶液和精子脫水現(xiàn)在常用CPM: 單一甘油型 G－Y－C型（甘油－卵黃－檸檬酸鈉型） TEST－G－Y－C（TES－Tris緩沖系統(tǒng)＋GYC）型 G－Y－C－G型（GYC＋谷氨酰胺） 改良T－G型（改良Tyrode液－甘油型）,12,冷凍保護(hù)劑 （CPM）,改良T－G型，它的優(yōu)點(diǎn) 有：相比有較好的冷凍復(fù)蘇率（本精子庫平均62.6％）可準(zhǔn)確配制不

8、含卵黃，消除可能的病毒感染和過敏反應(yīng)背景清晰，無大量顆粒和碎片儲存時(shí)間長，可達(dá)3個月,13,降溫程序,分類： 程序降溫：利用程序降溫儀進(jìn)行精確降溫。   手工降溫：利用現(xiàn)有降溫設(shè)備和液氮蒸氣分步驟降溫。注：由于現(xiàn)在還沒有找到降溫過程中各個溫區(qū)最佳降溫速率，文獻(xiàn)報(bào)道的各種降溫程序精液復(fù)蘇率效果不一！降溫前處理： 在室溫中將精液與CPM 1:1混勻，通常是在20min逐量加入，且用振蕩器持續(xù)振

9、蕩，轉(zhuǎn)速約300/min。此過程在提高精液復(fù)蘇率中起重要作用之一。,14,降溫程序,程序降溫 得到多數(shù)學(xué)者的認(rèn)同，有精確定降溫速率控制，復(fù)蘇率較高。缺點(diǎn)是儀器昂貴，使用和維護(hù)費(fèi)用也較高，不適合普及。,15,降溫程序,手工降溫：25℃（RT下加CPM）—4℃-20min—LV（LN上5cm處）-10min—LN25℃（RT下加CPM）—4℃-60min—－20℃-20min—LN25℃（RT下加CP

10、M）—4℃-20min—－20℃-20min—LV（LN上5cm處）-5min—LN25℃（RT下加CPM）—LV（LN上5cm處）-15min—LN,16,復(fù)溫程序,原則：是快凍快復(fù)、慢凍慢復(fù) 方法：37℃水浴快速復(fù)溫復(fù)溫?fù)p傷機(jī)制：Mohammad等連續(xù)觀察精子在冷凍過程中的損傷情況發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的細(xì)胞損傷發(fā)生在復(fù)蘇期。當(dāng)快速降溫時(shí)使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生小冰晶，如果緩慢復(fù)溫，小冰晶將會融合成大冰晶對細(xì)胞形成損傷；當(dāng)慢速降溫時(shí)細(xì)胞外的水分首先

11、結(jié)冰，胞外溶質(zhì)濃度升高導(dǎo)致精子細(xì)胞脫水，快速復(fù)溫使胞外的水分來不及回滲，造成精子的皺縮，形成溶質(zhì)性損傷。,17,冷凍復(fù)溫后的處理,使用精子營養(yǎng)液可使復(fù)溫后的精子在較長時(shí)間內(nèi)保持良好的活動率。使用化學(xué)物質(zhì)如：己酮可可堿（PF）、2-脫氧腺苷（2-DA）提高冷凍復(fù)蘇后的精子的活率和活力。,18,精液研究的新進(jìn)展,玻璃化低溫保存 最理想化的精液保存方法。指在溶液降溫過程中，相變后直接轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)（玻璃態(tài)）的固態(tài)。由于玻

12、璃態(tài)分子間的關(guān)系和液態(tài)沒有明顯變化，可避免冰晶形成過程中對細(xì)胞的損傷。要形成玻璃態(tài)必須有兩個條件：有極大的冷卻速率；極大增加溶液的濃度。,19,精液研究的新進(jìn)展,冷凍損傷的新理論：活性氧（ROS）的損傷： 精液冷凍過程中產(chǎn)生較多的活性氧，特別是標(biāo)本中白細(xì)胞含量較高時(shí)。從樣本中除去白細(xì)胞或冷凍前用抗氧化劑處理，可以提高精子的活力和功能。膜穿透性：不同保護(hù)劑成分對細(xì)胞膜的穿透性，水對細(xì)胞膜的穿透性，它們的大小決定了冷凍保護(hù)劑

13、與精液混合時(shí)平衡的時(shí)間及降溫速率。穿透性越大的冷凍保護(hù)劑可以得到較高的冷凍復(fù)蘇率。,20,精液研究的新進(jìn)展,冷凍保護(hù)劑滲透壓冷凍保護(hù)劑滲透壓的大小也是導(dǎo)致精液冷凍損傷的主要因素之一。冷凍保護(hù)劑滲透壓>2000mOsm時(shí)大部分細(xì)胞膜會受到破壞。這一損傷同時(shí)也與細(xì)胞本身可以承受滲透壓變化的程度，在冷凍和復(fù)溫過程中，如果滲透壓變化超過細(xì)胞本身承受能力，嚴(yán)重的細(xì)胞將死亡。冷打擊 精子從室溫降到0℃時(shí)會受到損傷，我們稱之為冷打擊。它

14、往往決定于精子本身抗冷打擊的能力。,21,本精子庫冷凍試驗(yàn)進(jìn)展,已建立合理的精液冷凍程序共進(jìn)行精液冷凍試驗(yàn)169例，平均復(fù)蘇率達(dá)62.6％隨著條件不斷的摸索，冷凍復(fù)蘇率也在不斷地提高；已建立比較穩(wěn)定的精液冷凍方法，冷凍復(fù)蘇率完全滿足衛(wèi)生部的要求。,22,精液冷凍研究的方向,尋找更加適合精液冷凍的冷凍保護(hù)劑；探討滲透壓對精液冷凍產(chǎn)生的影響；活性氧（ROS）對精液冷凍產(chǎn)生的影響及應(yīng)對方法；根據(jù)冷凍保護(hù)劑選擇各個降溫區(qū)最佳降溫速度