代表性全氟-多氟化合物對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響和機(jī)制研究.pdf

1、全氟/多氟化合物（PFASs）具有良好的穩(wěn)定性和疏水疏油特性，廣泛應(yīng)用于耐水涂料、食品包裝和滅火泡沫等工業(yè)和民用領(lǐng)域。由于其大量生產(chǎn)和使用，且具有持久性有機(jī)污染物的特性，在各種環(huán)境介質(zhì)和全球各地的人體血清中都檢測到 PFASs。許多國家嚴(yán)格控制并逐步淘汰全氟辛烷磺酸（PFOS）和全氟辛酸（PFOA）及相關(guān)化學(xué)品，但某些行業(yè)仍可生產(chǎn)和使用。此外，PFOS替代品迅猛發(fā)展，生產(chǎn)和使用量劇增，但其環(huán)境污染水平和毒理學(xué)研究極少，環(huán)境和健康風(fēng)險(xiǎn)未知

2、。與中國大多數(shù)其他地區(qū)相比，大連市在各種環(huán)境介質(zhì)甚至人類血清中的PFASs濃度較高，該地區(qū)PFASs的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體解剖結(jié)果表明，骨組織可能是PFASs的靶組織。流行病學(xué)調(diào)查顯示，人體血清 PFASs濃度與骨骼健康之間具有一定的關(guān)聯(lián)。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs)是成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞的共同祖細(xì)胞，在維持骨骼健康中起到重要作用，能夠?yàn)檠芯凯h(huán)境污染物對骨骼健康的影響及潛在分子機(jī)制提供有效的檢測體系。
　　

3、本論文首先通過對大連地區(qū)大氣顆粒物中 PFASs的監(jiān)測研究典型全氟烷酸化合物（PFAAs）及其替代品的環(huán)境污染時(shí)間規(guī)律。結(jié)合本論文和其他研究結(jié)果，選取5種污染水平較高的代表性PFASs，從細(xì)胞毒性、細(xì)胞分化、基因和蛋白表達(dá)等多水平評價(jià)幾種代表性PFASs暴露對hBMSCs分化的影響及潛在分子機(jī)制。主要內(nèi)容包括：
　　（1）分析大連地區(qū)大氣中PFASs的污染水平和時(shí)間趨勢。結(jié)果顯示：PFAAs的總量范圍為35.7-860 pg/m3

4、，在2006-2008年的污染水平上升，之后下降，且全氟羧酸（PFCAs）是主要物質(zhì)，其中PFOA檢測水平最高，平均濃度為71.7 pg/m3。全氟磺酸化合物（PFSAs）中PFOS濃度最高，其次是PFBS和PFHxS。在2007-2014年，PFOS替代品-氯代多氟醚基磺酸鹽（Cl-PFESA,商品名F-53B）濃度逐漸增加，范圍為85.9-722 pg/m3，占PFASs總量的37%至95%。
　?。?）通過分析堿性磷酸酶（A

5、LP）活性和鈣結(jié)節(jié)以及成骨分化過程中關(guān)鍵基因表達(dá)，研究PFASs暴露對hBMSCs成骨分化的影響。F-53B、PFOA、PFHxS和PFBS在一定濃度范圍內(nèi)對第7天ALP活性產(chǎn)生抑制作用，而PFOS對第7天ALP活性不產(chǎn)生顯著影響。PFOS抑制hBMSCs成骨分化過程中鈣結(jié)節(jié)的形成，且在0.2-100 nM之間以劑量依賴性的方式降低。100 nM PFOS暴露使鈣結(jié)節(jié)形成相對于對照組下降了65%。F-53B對鈣結(jié)節(jié)形成產(chǎn)生促進(jìn)作用。實(shí)時(shí)

6、定量PCR（RT-qPCR）結(jié)果顯示，PFOS暴露引起Runx2、ON和OPN表達(dá)下調(diào)，在100 nM處，ON和OPN分別下調(diào)了47%和26%。高濃度PFHxS下調(diào)BMP2和OPN表達(dá)，PFBS抑制Runx2、ON和OPG表達(dá)，而F-53B和PFOA誘導(dǎo)成骨分化相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，提示全氟磺酸化合物和PFOA、F-53B可能對成骨分化調(diào)控產(chǎn)生相反的作用。此外，PFOS顯著下調(diào)骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物OPG表達(dá)，且在0.2-100 nM之間以劑量依賴性

7、的方式降低。PFOS在100 nM時(shí)使OPG下調(diào)了41%。F-53B和PFHxS上調(diào)骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物RANKL表達(dá)。PFASs暴露引起RANKL/OPG比值大于1，提示PFASs可能通過OPG/RANKL/RANK通路影響破骨細(xì)胞的分化和活性。
　?。?）通過分析脂肪滴形成和成脂關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，研究不同濃度PFASs暴露對hBMSCs成脂分化的影響。油紅O染色結(jié)果表明，PFOS、PFHxS和低濃度PFBS暴露增加hBMSCs成脂分

8、化過程中的脂肪滴形成，且PFOS和PFHxS在0.2-100 nM之間脂肪滴形成隨濃度升高而增加。F-53B和PFOA暴露抑制的脂肪滴形成，且F-53B的抑制效應(yīng)呈劑量依賴性。RT-qPCR結(jié)果表明，PFOS和 PFHxS上調(diào) PPARγ、C/EBPα和LPL表達(dá)，PFOA下調(diào)PPARγ和LPL表達(dá)，F(xiàn)-53B上調(diào)CEBPα和LPL表達(dá)，說明PFOS和PFHxS暴露促進(jìn)hBMSCs成脂分化，PFOA抑制hBMSCs成脂分化，F(xiàn)-53B可

9、能主要通過影響成脂關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄后的翻譯，抑制hBMSCs成脂分化過程中脂肪滴的形成。
　　（4）通過分析 hBMSCs成骨分化不同階段 Runx2、PPARγ和β-catenin以及經(jīng)典Wnt/β-catenin通路上下游關(guān)鍵基因表達(dá)和關(guān)鍵蛋白水平，并結(jié)合經(jīng)典 Wnt-β-catenin通路激活劑LiCl，研究PFOS暴露影響hBMSCs分化的潛在分子機(jī)制。在成骨分化早期，PFOS暴露下調(diào)Runx2和β-catenin表達(dá)，變化趨

10、勢一致，且激活劑LiCl能夠減弱甚至逆轉(zhuǎn)由PFOS暴露所引起的β-catenin、OPN和ON表達(dá)顯著性下調(diào)。在成骨分化晚期，Runx2表達(dá)顯著性下調(diào)，PPARγ以劑量依賴的方式顯著性上調(diào)，在200 nM PFOS處，PPARγ上調(diào)3.12倍。β-catenin在基因和蛋白表達(dá)水平均無顯著變化，提示經(jīng)典Wnt-β-catenin通路主要在成骨分化早期對PFOS影響hBMSCs成骨分化起到關(guān)鍵作用，而PPARγ在成骨分化晚期具有重要調(diào)控作