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1、測序知識概述,,Invitrogen Proprietary & Confidential,2,Content,普通測序及測序相關(guān)基礎(chǔ)知識普通測序生產(chǎn)流程介紹困難模板測序相關(guān)知識困難模板測序生產(chǎn)流程介紹測序簡單問題解答,Invitrogen Proprietary & Confidential,3,普通測序及測序相關(guān)基礎(chǔ)知識——基本概念,什么是DNA以及DNA測序又稱脫氧核糖核酸，是染色體的主要化學(xué)成分，同時(shí)也

2、是組成基因的材料。     DNA分子極為龐大(分子量一般至少在百萬以上)，主要組成成分是腺嘌呤脫氧核苷酸、鳥嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸和胸腺嘧啶脫氧核苷酸（簡稱A、T、C、G）。DNA存在于細(xì)胞核、線粒體、葉綠體中，也可以以游離狀態(tài)存在于某些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。大多數(shù)已知噬菌體、部分動物病毒和少數(shù)植物病毒中也含有DNA。    除了RNA(核糖核

3、酸)和噬菌體外，DNA是所有生物的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。生物體親子之間的相似性和繼承性即所謂遺傳信息，都貯存在DNA分子中。,Invitrogen Proprietary & Confidential,4,普通測序及測序相關(guān)基礎(chǔ)知識——基本概念,DNA的結(jié)構(gòu)DNA共有四級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)：由多個(gè)4種脫氧核苷酸分子通過3’，5’—磷酸二酯鍵連接形成的直線型或環(huán)型多聚體。 二級結(jié)構(gòu)：在堿基互補(bǔ)配對的基礎(chǔ)上形成的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。三級

4、結(jié)構(gòu)：在二級結(jié)構(gòu)上，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)通過折疊和扭曲所形成的特定構(gòu)象。如超螺旋等。四級結(jié)構(gòu)：指DNA與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物。如染色體（質(zhì)）?！狣NA測序就是測定DNA的一級結(jié)構(gòu),Invitrogen Proprietary & Confidential,5,普通測序及測序相關(guān)基礎(chǔ)知識——基本概念,DNA結(jié)構(gòu)示意圖——單核苷酸及DNA的二級結(jié)構(gòu)——4種脫氧核苷酸分子通過3’，5’—磷酸二酯鍵連接形成的直線型或環(huán)型多

5、聚體。,Invitrogen Proprietary & Confidential,6,普通測序及測序相關(guān)基礎(chǔ)知識——基本概念,DNA結(jié)構(gòu)示意圖——DNA的三級結(jié)構(gòu)：雙螺旋DNA進(jìn)一步扭曲盤繞則形成其三級結(jié)構(gòu)，超螺旋是DNA三級結(jié)構(gòu)的主要形式。,。,Invitrogen Proprietary & Confidential,7,普通測序及測序相關(guān)基礎(chǔ)知識——基本概念,DNA結(jié)構(gòu)示意圖——DNA的四級結(jié)構(gòu)： DNA與蛋白質(zhì)

6、形成的復(fù)合物。如染色體（質(zhì)）。,Invitrogen Proprietary & Confidential,8,普通測序及測序相關(guān)基礎(chǔ)知識——基本概念,DNA測序原理目前DNA測序的原理是Sanger雙脫氧鏈末端終止法，簡單來說，就是單引物擴(kuò)增的PCR反應(yīng)，但是將PCR反應(yīng)體系中的dNTP換成了帶有熒光標(biāo)記的ddNTP和dNTP的混合物。目前最普遍的DNA測序技術(shù)是采用四色熒光分別標(biāo)記四種ddNTP. 一個(gè)樣品的測序反應(yīng)只

7、需在同一反應(yīng)體系中同時(shí)加入四種ddNTP. 產(chǎn)物無須分離即可在一個(gè)泳道中電泳.序列的讀取依靠檢測器對不同熒光的區(qū)分.并需要通過軟件系統(tǒng)的分析.動畫演示：http://www.bbioo.com/video/2005/43.htm目前測序需要使用的儀器A.PCR擴(kuò)增儀B.3730XL全自動熒光測序儀,Invitrogen Proprietary & Confidential,9,普通測序及測序相關(guān)基礎(chǔ)知識——測序模板

8、的要求,測序分析軟件A. Sequencing Analysis 5.2，用于將測序原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為峰圖文件B.DNAStar,用于將測序得到的結(jié)果進(jìn)行拼接C.Chromas，用于顯示DNA測序峰圖文件測序模板的要求PCR產(chǎn)物直接測序 PCR已純化產(chǎn)物：提供切膠回收純化后的PCR產(chǎn)物20ul (濃度大于50 ng/μl), 并請?zhí)峁舛?(濃度須正確) 大于3.2 pmol/μl的測序引物10～20 μl（具體體積視客戶

9、反應(yīng)數(shù)相應(yīng)增加）。未純化PCR產(chǎn)物：提供至少40ulPCR擴(kuò)增原液，送樣前取2ul經(jīng)瓊脂糖膠鑒定目的片斷為明亮的一條帶, 同時(shí)請?zhí)峁舛?(濃度須正確) 大于3.2 pmol/μl的測序引物10～20 μl （具體體積視客戶反應(yīng)數(shù)相應(yīng)增加）。,Invitrogen Proprietary & Confidential,10,普通測序及測序相關(guān)基礎(chǔ)知識——測序模板的要求,注意事項(xiàng):PCR產(chǎn)物直接測序成功的關(guān)鍵是PCR產(chǎn)物的純

10、度，所以我們提倡用膠回收PCR產(chǎn)物。如果有幾條PCR產(chǎn)物長度相近，用電泳膠也無法分開時(shí)，此時(shí)的PCR產(chǎn)物直接測序會出現(xiàn)雙峰，這種情況建議把PCR產(chǎn)物克隆后測序。PCR已純化產(chǎn)物請用水稀釋不要用elution buffer。PCR產(chǎn)物直接測序成功的另一要因是引物。不是能做PCR反應(yīng)的引物便一定能測序。測序用引物要求較高,引物的3‘端必須與模板完全配對，含有Mix堿基的引物一般不能測序 (特別是3’端)。此外，測序引物長度一般為20個(gè)堿基

11、左右，GC含量必須在50～60%左右，TM值在55-65度之間。盡量保證測序引物的純度。并且引物需要用水而非TE溶解。PCR未純化產(chǎn)物最好不要添加染料。,Invitrogen Proprietary & Confidential,11,普通測序及測序相關(guān)基礎(chǔ)知識——測序模板的要求,質(zhì)粒DNA的測序 質(zhì)粒樣品：請注明載體名稱及是否含有特殊結(jié)構(gòu)、插入片段的長度及插入片段的酶切位點(diǎn)情況、請?zhí)峁┲辽?5ul以上的提純的質(zhì)粒DNA

12、，濃度大于200 ng/μl（體積視客戶反應(yīng)個(gè)數(shù)適當(dāng)增加）。含有質(zhì)粒的菌液/沉淀菌體/平板菌/穿刺菌樣品：請注明菌體的種類及抗生素抗性的情況、所含載體的名稱及結(jié)構(gòu)情況、插入片段的長度及插入片段的酶切位點(diǎn)情況、如果有特殊抗生素添加比例或培養(yǎng)條件特殊須注明。含有噬菌體DNA的樣品公司均不提供此類抽提服務(wù)，請客戶提供質(zhì)粒形態(tài)的樣品20ul ，濃度大于50 ng/μl。務(wù)必需要客戶注明是含有噬菌體DNA的質(zhì)粒。,Invitrogen

13、Proprietary & Confidential,12,普通測序及測序相關(guān)基礎(chǔ)知識——測序引物的要求,長度在18-25bp之間GC含量在35%-60%之間不含兼并堿基TM值在55-65度之間無引物二聚體、無發(fā)夾結(jié)構(gòu)隨機(jī)引物和帶有熒光標(biāo)記的引物不能測序如果設(shè)計(jì)引物，最好引物距離目的基因50bp左右,Invitrogen Proprietary & Confidential,13,普通測序生產(chǎn)流程介紹,客戶樣

14、品送達(dá)公司后，需要3個(gè)階段A.模板制備階段B.測序反應(yīng)階段C.報(bào)告分析階段,Invitrogen Proprietary & Confidential,14,困難模板測序相關(guān)知識——困難樣品的定義和鑒別,困難樣品的定義和鑒別不滿足常規(guī)測序樣品質(zhì)量要求的樣品用常規(guī)測序反應(yīng)體系無法得到正常結(jié)果的樣品,Invitrogen Proprietary & Confidential,15,困難模板測序相關(guān)知識——困難樣品

15、的定義和鑒別,Invitrogen Proprietary & Confidential,16,困難模板測序相關(guān)知識——常規(guī)樣品與困難樣品的不同點(diǎn),Invitrogen Proprietary & Confidential,17,困難模板測序相關(guān)知識——常規(guī)樣品與困難樣品的不同點(diǎn),Invitrogen Proprietary & Confidential,18,測序簡單問題解答——術(shù)語講解,搖菌搖菌是指將客戶提

16、供的菌液、穿刺菌、平板菌接入液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，從而得到足夠用于抽提出一定濃度質(zhì)粒的過程。,劃平板平板是將用于細(xì)菌培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基，倒于平皿之上，待凝固后用于培養(yǎng)細(xì)菌。劃平板是用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線而達(dá)到純化分離微生物的一種方法。是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線”稀釋而達(dá)到分離的目的。用于目的微生物的分離、克隆的活化。（如圖）通知客戶“劃板失敗”，是即使我們通過將客戶的菌液通過劃平板處理，但是平

17、板上沒有菌落生長，證明克隆可能已經(jīng)沒有活力，建議客戶重新提供樣品。,Invitrogen Proprietary & Confidential,19,測序簡單問題解答——術(shù)語講解,抽質(zhì)粒質(zhì)粒是細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子抽質(zhì)粒是指用質(zhì)粒抽提試劑盒，采用堿裂解法，經(jīng)過裂解去除蛋白等步驟，從細(xì)菌中獲得質(zhì)粒DNA的過程。鑒定鑒定是指將抽提出的質(zhì)粒、客戶提供的質(zhì)粒&PCR已純化產(chǎn)物、PCR未純化產(chǎn)

18、物取2ul經(jīng)EB染色，點(diǎn)于1.3%瓊脂糖凝膠上，通過觀察DNA樣品條帶亮度對樣品濃度進(jìn)行判定的過程。,Invitrogen Proprietary & Confidential,20,測序簡單問題解答——術(shù)語講解,條帶條帶是DNA樣品（質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物）經(jīng)過EB染色，在瓊脂糖膠上形成的明亮帶，條帶的存在證明客戶的樣品中存在一定量的DNA模板(如圖)。通常，我們通知客戶“無條帶”的意思是：客戶的樣品我們經(jīng)EB染色，在瓊脂糖膠上沒

19、有亮帶，證明客戶提供的樣品中，沒有DNA模板，或模板含量極低，不能用于測序。條帶弱的意思是與DNA Marker相比，條帶亮度弱，無法從膠中回收產(chǎn)物。,Invitrogen Proprietary & Confidential,21,測序簡單問題解答——術(shù)語講解,PCRPCR是Polymerase Chain Reaction 的簡稱，即聚合酶鏈鎖反應(yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變

20、性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。 PCR反應(yīng)原理演示http://www.bbioo.com/video/2006/351.htm對于前面講到的“條帶弱”或“無條帶”的樣品，目前測序部會為客戶進(jìn)行PCR擴(kuò)增服務(wù)（暫為免費(fèi)服務(wù)），在客戶提供上下游引物的前提下，測序部依照常規(guī)PCR反應(yīng)條件為客戶進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，如果可以正常擴(kuò)出條

21、帶（PCR成功）即可繼續(xù)為客戶安排測序反應(yīng)，如果不能正常擴(kuò)出條帶，則備注為PCR失敗，還需客戶重新提供制備樣品。質(zhì)粒樣品也可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，一般測序部是以載體上的通用引物為濃度低的質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。,Invitrogen Proprietary & Confidential,22,測序簡單問題解答——術(shù)語講解,轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。TA克隆T

22、A克隆即利用Taq聚合酶同時(shí)具有的末端連接酶的功能，在每條PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3`端自動添加一個(gè)3`-A突出端，TA克隆載體提供一個(gè)線性含3`-T突出端用于直接高效地連接PCR產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞的過程。我們采用TaKaRa公司（PMD18T克隆載體）和Invitrogen公司TA克隆系統(tǒng)（Topo TA克隆系統(tǒng)）。,Invitrogen Proprietary & Confidential,23,測序簡單問題解答

23、——常見問題解答,什么是walking測序？對于插入片斷較長的DNA樣品，一個(gè)測序反應(yīng)往往不能達(dá)到測通的目的，這個(gè)時(shí)候需要進(jìn)行walking測序，即以已經(jīng)測序得到的結(jié)果為基礎(chǔ)，在測序得到的序列上設(shè)計(jì)引物繼續(xù)向下（上）游測序的方法。一般來說，第一個(gè)正向walking反應(yīng)測序部將命名為w1f，第一個(gè)反向walking反應(yīng)測序部命名為w1r，對于未知客戶序列方向的命名為w1p，對于向反向互補(bǔ)鏈進(jìn)行測序的命名為w1pc。以此類推到第N個(gè)反應(yīng)。

24、如下圖所示,Invitrogen Proprietary & Confidential,24,測序簡單問題解答——常見問題解答,如何查詢載體與引物？每個(gè)公司均會整理常用的載體與引物表，客戶可向相關(guān)測序公司索要載體及對應(yīng)引物表格，以及咨詢公司能提供客戶使用的通用引物。測序結(jié)果中怎么找不到測序引物？（用自備引物測序，前面怎么缺了一段？）由于測序引物不被熒光標(biāo)記，所以不發(fā)射熒光信號，在測序結(jié)果中，是不顯示的。不論自備引物還是通

25、用引物，在測序結(jié)果中，都是看不到的。由于受到反應(yīng)體系中殘留的BDT反應(yīng)底物影響，測序結(jié)果前端受到該小分子物質(zhì)的影響，所以不太準(zhǔn)確，因而測序引物后大約20-30bp在測序結(jié)果中不顯示。測序結(jié)果文件名的意義如A04.CS080904823_8037.PQEK834#.W2R(08154058) A04：96孔PCR反應(yīng)板對應(yīng)樣品孔號CS080904823：訂單號PQEK834#：客戶樣品名稱W2R：測序引物,Invitrog

26、en Proprietary & Confidential,25,測序簡單問題解答——常見問題解答,困難模板需要客戶注明哪些特殊情況？菌：是否低拷貝、質(zhì)粒大小、培養(yǎng)特殊條件（培養(yǎng)溫度、抗性及抗生素濃度、培養(yǎng)基特殊要求）、載體情況、序列是否有發(fā)夾、GC高、AT高、重復(fù)序列等特殊情況。質(zhì)粒：質(zhì)粒大小、載體情況、序列是否有發(fā)夾、GC高、AT高、重復(fù)序列等特殊情況。如需轉(zhuǎn)化需要提供是否低拷貝、培養(yǎng)特殊條件（培養(yǎng)溫度、抗性及抗生素濃

27、度、培養(yǎng)基特殊要求）。PCR產(chǎn)物：產(chǎn)物片斷大小、擴(kuò)增引物序列、擴(kuò)增條件、序列是否有發(fā)夾、GC高、AT高、重復(fù)序列等特殊情況。如有已知序列，需要一并提供。,Invitrogen Proprietary & Confidential,26,測序簡單問題解答——常見問題解答,困難模板需要客戶準(zhǔn)備的材料菌：菌液、平板菌、穿刺菌、沉菌；如有特殊要求可提供自備引物。如有特殊抗性，需要客戶提供抗生素。（我們能提供的抗生素：氨芐、羧芐、卡