厭氧氨氧化細(xì)菌的菌種鑒定方法的優(yōu)化及運(yùn)用研究.pdf

1、本論文采用一系列分子生物學(xué)的方法對(duì)具有厭氧氨氧化功能的ASBBR反應(yīng)器中的污泥進(jìn)行微生物的定性分析,建立了定量分析的體系,以期為反應(yīng)器的運(yùn)行狀況和反應(yīng)機(jī)理提供技術(shù)支持。
　　首先采用MPfastDNAspinKit(forsoil)試劑盒提取DNA,然后設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增;將PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE),可以反映活性污泥中微生物的多樣性;并將清晰的條帶(優(yōu)勢(shì)菌)割膠回收,回收的產(chǎn)物再次PCR,送至

2、上海生工進(jìn)行克隆和測(cè)序,并要求返還質(zhì)粒;將得到的序列進(jìn)行BLAST比對(duì),建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),達(dá)到對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌的定性分析;用質(zhì)粒做實(shí)時(shí)定量PCR,先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),今后便可作為其他樣品定量的標(biāo)準(zhǔn),以達(dá)到定量的目的。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:ASBBR反應(yīng)器的污泥里同時(shí)存在著厭氧氨氧化菌和好氧氨氧化菌。通過(guò)變性梯度凝膠電泳(DGGE)觀(guān)察了兩種菌的多樣性,發(fā)現(xiàn)好氧氨氧化菌的種類(lèi)比厭氧氨氧化菌的種類(lèi)多。將厭氧氨氧化菌的圖譜上兩條優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行割膠

3、回收、克隆并測(cè)序。結(jié)果表明,這兩個(gè)樣品的序列完全相同;將測(cè)得的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行BLAST比對(duì),并建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),發(fā)現(xiàn)與GenBank上已經(jīng)公布的厭氧氨氧化菌同屬分支很深的浮霉細(xì)菌(planctomycete(AJ131819))的同源性為99％,可以認(rèn)為是浮霉菌屬的一種。將好氧氨氧化菌圖譜上的兩條優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行克隆和測(cè)序,得出兩種不同的序列,發(fā)現(xiàn)這兩種菌均屬于氨單加氧酶。因此ASBBR反應(yīng)器中存在的厭氧氨氧化菌和好氧氨氧

4、化菌存在著協(xié)同作用:原水中帶入反應(yīng)器中的氧氣可由好氧氨氧化細(xì)菌消耗,把氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽;氧氣消耗完后,厭氧氨氧化細(xì)菌則利用剩余的氨和亞硝酸鹽進(jìn)行anammox反應(yīng)。因而,反應(yīng)器中的氨氮與亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化比值為1.30,低于理論的anammox反應(yīng)計(jì)量比1.32。
　　對(duì)厭氧氨氧化菌的圖譜上兩條優(yōu)勢(shì)條帶克隆后,將其中一個(gè)樣品做實(shí)時(shí)定量PCR,建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),可用于其它厭氧氨氧化污泥的定量分析。
　　厭氧氨氧化工藝以其無(wú)需氧氣、