5.酶工程-西安理工大學(xué)理學(xué)院

1、酶工程,酶,定義：一種生物催化劑，具有作用專一性強(qiáng)、催化效率高等特點(diǎn)，能在常溫常壓和低濃度條件下進(jìn)行復(fù)雜的生化反應(yīng)。包括核酶及蛋白質(zhì)酶。,酶工程,酶 工 程,酶工程,定義 利用酶的特異催化功能，將一種物質(zhì)轉(zhuǎn)化為另一種物質(zhì)的技術(shù).,優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的篩選,基本步驟采樣 ? 菌種分離 ? 產(chǎn)酶性能測(cè)定 ? 復(fù)篩,酶工程,基因工程菌的構(gòu)建,酶工程,定義 在人工控制的條件下，有目的地利用微生物培養(yǎng)來生產(chǎn)所需的酶。包括培養(yǎng)基的選擇

2、發(fā)酵方式的選擇發(fā)酵條件的控制管理,酶工程,微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn),碳源 淀粉、糖蜜、蔗糖等。 氮源 有機(jī)氮（豆餅粉、花生餅粉）、無 機(jī)氮無機(jī)鹽類 低濃度有利于酶產(chǎn)量的提高， 有些金屬離子是酶的組分。 生長因子 細(xì)胞生長必需的微量有機(jī)物，如維生素、氨基酸、嘌呤堿、嘧啶堿。pH值 應(yīng)根據(jù)微生物的需要調(diào)節(jié)pH值。,培養(yǎng)基,酶工程,固體發(fā)酵 用于真菌的酶生產(chǎn)。方法簡單，但操作條件不易控制。

3、液體深層發(fā)酵 關(guān)鍵是對(duì)溫度、通氣、攪拌和pH的控制。產(chǎn)品回收和提純工藝簡便。,酶的發(fā)酵生產(chǎn)方式,酶工程,添加誘導(dǎo)物 分為①酶的作用底物；②酶的反應(yīng)產(chǎn)物；③酶底物類似物。降低阻遏物濃度 措施：分次添加碳源、產(chǎn)物類似物可解除反饋?zhàn)瓒簟１砻婊钚詣?肥離子型表面活性劑常被用作產(chǎn)酶促進(jìn)劑。,提高酶產(chǎn)量的措施,酶工程,工業(yè)用酶 一般無需高度純化，如洗滌用蛋白酶。食品工業(yè)用酶 需適當(dāng)?shù)姆蛛x純化，以確保安全衛(wèi)生。醫(yī)

4、藥用酶 需經(jīng)過高度純化，不能含有熱源物質(zhì)。,酶工程,酶的分離純化,基本原則 提取過程中避免酶變性而失去活性；防止強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和劇烈攪拌；要求在低溫下操作；低鹽濃度；操作中加入緩沖溶液；防止微生物的污染。,酶工程,酶的分離純化,酶工程,酶制劑的制備,破碎細(xì)胞 對(duì)胞內(nèi)酶的提取。有機(jī)械破碎法、酶法、化學(xué)試劑法、物理破碎法。溶劑抽提 稀酸、稀堿、稀鹽溶液。分離 離心機(jī)、板框壓濾機(jī)。濃縮 吸附、沉淀、凝膠過濾、真

5、空薄膜濃縮。干燥 固體酶比液體酶保存時(shí)間長。常用方法有真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥。,酶工程,酶的純化與精制,離心分離 凝膠過濾透析與超濾,根據(jù)分子大小和形狀,根據(jù)酶分子電荷性質(zhì),離子交換層析 層析聚焦電泳等電聚焦,凝膠過濾,,指混合物隨流動(dòng)相經(jīng)過固定相(凝膠)的色譜柱時(shí)，混合物中各組分按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。又稱分子篩色譜。,酶工程,組成上的特點(diǎn),固定相（凝膠） 是一種不帶電荷的具

6、有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，凝膠的每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)就如一個(gè)篩子，小的分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，而大的分子則排阻于凝膠顆粒之外，因而具分子篩的性質(zhì)。又因整個(gè)色譜過程一般不變換洗脫液，好象過濾一樣，故稱凝膠過濾。,凝膠過濾,,凝膠過濾分離示意圖,,,（1）樣品溶液加在色譜 柱頂端；,（2）樣品溶液流經(jīng)色譜 柱，小分子通過擴(kuò) 散作用進(jìn)入凝膠顆 粒的微孔中，而大 分子則被排阻于顆

7、 粒之外。大、小分 子因向下移動(dòng)的速 度發(fā)生差異而被分 離開來；,（3）向色譜柱頂加入洗 脫液，大、小分子 分開的距離增大；,（4）大分子已經(jīng)流出色 譜柱,凝膠過濾,透析,,其特點(diǎn)是半透膜兩邊都是液相，一邊是試驗(yàn)液，另一邊是純凈溶劑（水或緩沖液）。試驗(yàn)液中不可透析的大分子被截留于膜內(nèi)，可透析的小分子經(jīng)擴(kuò)散作用不斷透出膜外，直到兩邊濃度達(dá)到平衡。,透析法多用于制備及提純生

8、物大分子時(shí)除去或更換小分子物質(zhì)、脫鹽和改變?nèi)軇┏煞帧?酶的分離方法,透析袋簡單裝置,,,,酶的分離方法,超濾,加正壓在膜兩邊產(chǎn)生壓差的方法 產(chǎn)生負(fù)壓,,原理 加壓膜技術(shù)之一，與一般過濾一樣，主要依賴于被分離物質(zhì)分子量的大小、形狀和性質(zhì)不同，在一定的壓力差（外源N2或真空泵壓）下，使小分子能夠通過具有一定孔徑的特制薄膜，限額以上的大分子被膜阻留，使不同大小的分子得以分離

9、。,,酶的分離方法,超濾示意圖,,,超濾,離子交換層析法,原理 離子交換樹脂是一種具有離子交換能力的高分子化合物，不溶于水、酸、堿及普通有機(jī)溶劑，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。由兩部分組成：樹脂的骨架(R)，是多價(jià)高分子基團(tuán)，具不溶于水的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；交換基（可擴(kuò)散離子），具有可交換的離子活性基團(tuán)，這兩部分帶有相反電荷。,,組成 固定相:離子交換樹脂 流動(dòng)相:需要分離的溶液,酶的分離方法,陽離子樹脂,R+OH- + M+A-

10、 R+A- + M+OH-,,可擴(kuò)散離子是陽離子,離子交換法,陰離子樹脂 可擴(kuò)散離子是陰離子,交換過程,離子交換層析包括吸附、吸收、穿透、擴(kuò)散、離子交換、離子親和等過程，是綜合作用的結(jié)果。,,離子交換法,酶工程,酶活力,酶活力 酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。通常用國際單位表示：以最佳條件或某一固定條件下每分鐘催化生成1μmol產(chǎn)物所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位U（Unit）。 一個(gè)“Katal”單位是指在一定條

11、件下1秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物所需的酶量。 Kat和U的換算關(guān)系：1 Kat=6×107U,酶工程,酶的比活力,比活力（specific activity） 每單位（mg或mL）蛋白質(zhì)中的酶活力單位數(shù)，如：U(或Kat)/mg（或mL）蛋白。對(duì)同一種酶來講，比活力愈高則表示酶的純度越高（含雜質(zhì)越少），所以比活力是評(píng)價(jià)酶純度高低的一個(gè)指標(biāo)。,酶工程,酶制劑的保存,溫度 酶的保存溫度一般在0-4℃。,緩

12、沖液 大多數(shù)酶在特定的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，偏離這個(gè)范圍便會(huì)失活，因酶不同而異。,氧化/還原 由于巰基易被氧化，這類酶應(yīng)加還原劑或在氬氣或氮?dú)庵斜４妗?蛋白質(zhì)的濃度及純度 酶濃度越高越穩(wěn)定，制備成晶體或干粉更有利于保存。,酶分子修飾 通過酶蛋白主鏈的剪接切割和側(cè)鏈的化學(xué)修飾對(duì)酶分子進(jìn)行改造，目的在于改變酶的一些性質(zhì)，創(chuàng)造出天然酶不具備的某些優(yōu)良性狀，擴(kuò)大酶的應(yīng)用以達(dá)到較高的經(jīng)濟(jì)效益。,酶分子的改造,酶工程,金屬離子置換修飾 大分

13、子結(jié)合修飾 肽鏈有限水解修飾 側(cè)鏈修飾,酶的化學(xué)修飾技術(shù),酶工程,微生物的基因經(jīng)修飾后能產(chǎn)生所需的酶,酶工程,酶分子的修飾,,酶分子的修飾,酶工程,酶的蛋白質(zhì)工程,酶的蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，仍需要應(yīng)用基因工程的全套技術(shù)。但酶的基因工程主要解決酶大量生產(chǎn)的問題，而蛋白質(zhì)工程則致力于天然蛋白質(zhì)的改造，制造各種定做的蛋白質(zhì)。,,酶的蛋白質(zhì)工程,,目前酶蛋白質(zhì)工程主要集中在工業(yè)用酶的改造。例如，用作洗衣粉添加酶的枯草

14、桿菌蛋白酶，能分解衣服上的血跡和汗?jié)n，但已被漂白劑氧化失活。改造方法：,Ser或Ala → 替代蛋白酶的222位Met →0.5mol/L H2O2中1h仍不失活 →與漂白劑混合使用,,酶的蛋白質(zhì)工程,,雜交酶,利用基因工程將來自兩種或兩種 以上酶的不同結(jié)構(gòu)片段構(gòu)建成的新酶。新構(gòu)建的雜交酶的特性，通常介于其雙親酶的特性之間。,,酶的蛋白質(zhì)工程,,模擬酶,在深入了解酶的結(jié)構(gòu)與功能以及催化作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，近10年來，有許多科學(xué)家模擬

15、酶的生物催化功能，用化學(xué)半合成法或化學(xué)全合成法合成了人工酶催化劑。,,酶的蛋白質(zhì)工程,,人工模擬酶,①半合成酶：例如將電子傳遞催化劑[Ru(NH)3]3+與巨頭鯨肌紅蛋白結(jié)合，產(chǎn)生了一種“半合成的無機(jī)生物酶”，把能和氧氣結(jié)合而無催化活性的肌紅蛋白變成能氧化各種有機(jī)物（如抗壞血酸）的半合成酶，它接近于天然的抗壞血酸氧化酶的催化效率?！、谌铣擅福菏且恍┓堑鞍踪|(zhì)有機(jī)物，通過并入酶的催化基團(tuán)與控制空間構(gòu)象，從而像天然酶那樣專一性地催化化學(xué)反

16、應(yīng)。例如，利用環(huán)糊精成功地模擬了胰凝乳蛋白酶、轉(zhuǎn)氨酶等。其中胰凝乳蛋白模擬酶催化簡單酯反應(yīng)的速率和天然酶接近，但熱穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性大大優(yōu)于天然酶，模擬酶的活力在80℃仍能保持，在pH2～13的大范圍內(nèi)都是穩(wěn)定的。,酶工程,酶的固定化,固定化酶（immobilized enzyme） 將水溶性的酶固定于固相載體上,形成具有酶活性的酶衍生物。在催化反應(yīng)中，它以固相狀態(tài)作用于底物，反應(yīng)完成后，容易與水溶性反應(yīng)物分離。優(yōu)點(diǎn)：仍具有酶的高度專

17、一性和高催化效率的特點(diǎn)，且比水溶性酶穩(wěn)定，可反復(fù)使用，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益。,,酶的固定化,酶的固定化方法,,,酶的固定化,,酶的固定化,,酶的固定化,,細(xì)胞的固定化,酶反應(yīng)器,酶工程,,酶反應(yīng)器,,酶反應(yīng)器,,酶反應(yīng)器,填充床型反應(yīng)器,,酶反應(yīng)器,膜式酶反應(yīng)器,,酶反應(yīng)器,生物傳感器,酶工程,是一類用生物活性物質(zhì)作敏感器件，配以適當(dāng)?shù)膿Q能器，將生物體內(nèi)的化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電、熱、光等訊號(hào)的傳感檢測(cè)器。,轉(zhuǎn)換器,電信號(hào),被檢測(cè)物質(zhì),固定化酶

18、膜,生物傳感器,第一代：由固定化酶膜和電化學(xué)器件組成 的酶電極； 第二代：微生物、細(xì)胞器、動(dòng)植物組織、 免疫等生物傳感器；第三代：生物電子學(xué)傳感器，將具有智能。,酶工程,關(guān)鍵元件：生物敏感膜（分子識(shí)別元件）,生物傳感器分類

19、,酶傳感器：酶膜作為識(shí)別元件。 組織傳感器：利用動(dòng)植物組織中多酶系統(tǒng)的催化 作用來識(shí)別分子。微生物傳感器：將微生物固定在膜上的生物傳感 器，利用其呼吸作用或所含的酶。免疫傳感器：利用抗體與抗原之間的高特異性，

20、 將抗體固定在電極表面制成工作電 極。場效應(yīng)晶體管生物傳感器：將生物技術(shù)與晶體管 工藝結(jié)合的第三代生 物傳感器。,酶工程,生物傳感器的發(fā)展前景,功能多樣化：未來的生物傳感器將進(jìn)一步涉及醫(yī)療保健、疾病診斷、食品檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、發(fā)酵工業(yè)的各個(gè)領(lǐng)域。目前, 重要是研究能代替生物視覺、聽覺

21、和觸覺等感覺器官的生物傳感器,即仿生傳感器。 微型化：隨著微加工技術(shù)和納米技術(shù)的進(jìn)步，生物傳感器將不斷地微型化，各種便攜式生物傳感器的出現(xiàn)使人們?cè)诩抑羞M(jìn)行疾病診斷，在市場上直接檢測(cè)食品成為可能。,酶工程,手掌型葡萄糖(glucose)分析儀,,生物傳感器的前景,智能化與集成化：未來的生物傳感器必定與計(jì)算機(jī)緊密結(jié)合，自動(dòng)采集數(shù)據(jù)、處理數(shù)據(jù)，更科學(xué)、更準(zhǔn)確地提供結(jié)果，實(shí)現(xiàn)采樣、進(jìn)樣、結(jié)果一條龍,形成檢測(cè)的自動(dòng)化系統(tǒng)。同時(shí),

22、芯片技術(shù)將越來越多地進(jìn)入傳感器領(lǐng)域,實(shí)現(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)的集成化、一體化。低成本、高靈敏度、高穩(wěn)定性和高壽命：生物傳感器技術(shù)的不斷進(jìn)步，必然要求不斷降低產(chǎn)品成本，提高靈敏度、穩(wěn)定性和延長壽命。這些特性的改善也會(huì)加速生物傳感器市場化、商品化的進(jìn)程。,發(fā)酵罐,主機(jī),計(jì)算機(jī),SBA-60型生物傳感在線分析系統(tǒng)，為發(fā)酵自動(dòng)控制提供了新的基礎(chǔ)平臺(tái),實(shí)驗(yàn)室制造的生物傳感分析儀,酶的應(yīng)用（1）,食品工業(yè)的多面手 利用淀粉作原料，通過α-淀

23、粉酶、糖化酶、固定化葡萄糖異構(gòu)酶的催化作用，生產(chǎn)出甜度比蔗糖高得多的高果糖槳。為醫(yī)藥工業(yè)闖新路 利用一種專一性的酶，切下并移去豬胰島素Ｂ鏈上的最后兩個(gè)丙氨酸，然后再邊接上一個(gè)蘇氨酸，這樣豬的胰島素就變成了人的胰島素，在治療人的糖尿病時(shí)就不會(huì)再產(chǎn)生免疫反應(yīng)了。,酶工程,酶的應(yīng)用（2）,洗衣刷碗的好幫手 日常洗滌用品中通常含有聚磷酸鈉、表面活性劑和氧化劑等成分。而在其中添加蛋白酶等酶制劑，開發(fā)出多功能、低污染、高效節(jié)能的洗滌用

24、品。化學(xué)工業(yè)的新伙伴 利用丙烯腈作原料生產(chǎn)用途廣泛的丙烯酰胺。飲料工業(yè)錦上添花 將蛋白酶、淀粉酶等作為添加劑補(bǔ)充給幼畜；在植物源飲料中添加水解草酸的酶，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子；添加纖維素酶，提高飲料利用率等。,酶工程,酶的應(yīng)用（3）,紡織工業(yè)又綻奇葩 利用蛋白酶去除絲毛織物中的絲膠蛋白；利用纖維素酶處理牛仔服和改良苧麻織物的性能等。造紙工業(yè)的希望 在制槳階段幫助漂白的木聚糖酶以及分解松木紙槳中松脂的脂肪酶和脫除廢紙油

25、墨的纖維素酶。得力的環(huán)境衛(wèi)士 利用磷酸脂酶原地降解有機(jī)磷神經(jīng)毒劑和殺蟲劑。,酶工程,酶的應(yīng)用（4）,基因工程必備工具 基因工程需要的限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶和DNA聚合酶等。神奇的檢測(cè)和傳感 用酶法分析代替?zhèn)鹘y(tǒng)的物理化學(xué)分析方法，精確地測(cè)定出血尿等液體中某一物質(zhì)的含量。,酶工程,結(jié) 束,返回總目錄,作 業(yè),一、術(shù)語解釋凝膠過濾、酶活力、比活力、酶分子修飾、雜交酶、酶固定化、酶反應(yīng)器、生物傳感器二、問答題1