第十二章固相膜免疫測(cè)定-長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院

1、第十二,第一節(jié) 概述 一、免疫測(cè)定分類 二、免疫測(cè)定原理 三、固相免疫測(cè)定 四、固相膜的特點(diǎn) 五、常用的固相膜 六、固相膜的技術(shù)要求,第十二章　固相膜免疫測(cè)定,,第二節(jié) 免疫金標(biāo)記技術(shù) 一、膠體金的制備第三節(jié) 膜載體免疫測(cè)定的種類與原理 一、膜固相免疫測(cè)定的特點(diǎn) 二、固相微孔膜測(cè)定種類 三、免疫滲濾試驗(yàn)和免疫層析試驗(yàn) 四、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn) 五、免疫印跡 六、放射免疫沉淀試驗(yàn),,

2、思考題小結(jié),,隨著免疫學(xué)技術(shù)和相關(guān)生物化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測(cè)方法上派生出了多種類型的固相膜免疫快速檢測(cè)試驗(yàn)。該類試驗(yàn)的最大特點(diǎn)是不需要大型設(shè)備，對(duì)檢測(cè)人員稍加培訓(xùn)即能掌握操作要求和判定標(biāo)準(zhǔn)。,第一節(jié) 概述,標(biāo)記免疫測(cè)定放射免疫測(cè)定 　 1960’酶免疫測(cè)定 　　 1970’熒光免疫測(cè)定 1980’－1990’化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定 1990’－膜固相免疫測(cè)定 1990’－,,一、免疫測(cè)定分類,免疫濁度測(cè)定

3、Ag + Ab AgAb + Ab標(biāo)記免疫測(cè)定 Ag + Ab* Ag Ab* + Ab* （B） （F）,,,,,二、免疫測(cè)定原理,利用抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)標(biāo)本中微量物質(zhì)　抗原+抗體 抗原抗體復(fù)合物 Ag +Ab 　Ag * Ab,,,,,三、固相免疫測(cè)定,B與F分離,Ab* Ab*Ag +

4、 Ag + Ab* Ab Ab,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,四、固相膜的特點(diǎn),多孔性 毛細(xì)管作用非共價(jià)鍵高度吸附抗體或抗原 高度敏感性易于漂洗 操作簡(jiǎn)便,五、常用的固相膜,玻璃纖維素(fiberglass)膜尼龍(nylon)膜聚偏氟乙稀( polyvinylidene flu

5、oride ，PVDF)膜硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜,六、固相膜的技術(shù)要求,孔徑：0.2~0.6 μm流速：以ml/cm2/min表示蛋白質(zhì)結(jié)合力：吸附力很強(qiáng)，以μg/cm2表示均一性,固相NC膜,第二節(jié)　免疫金標(biāo)記技術(shù),免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處

6、大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)。這一反應(yīng)也可以通過(guò)銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色（immunogold silver staining，IGSS）。,一、膠體金制備,膠體金（colloidal gold）的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液，也稱金溶膠（gold solu

7、tion）。,膠體金的制備及特性,*還原100 ml0.01%HAuCl4 所需量,,膠 體 金（Colloidal Gold）15~60 nm,優(yōu) 質(zhì),劣 質(zhì),膠體金結(jié)合物（Conjugate）,膜固相免疫測(cè)定的特點(diǎn),第三節(jié)　膜載體免疫測(cè)定的種類與原理,固相微孔膜測(cè)定種類,斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)(dot immunogold filtration assay, DIGFA)免疫層析試驗(yàn)（immunochromatography as

8、say, ICA）斑點(diǎn)ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 免疫印跡法(immunoblotting test, IBT) 放射免疫沉淀試驗(yàn)(radioimmunoprecipitation assay, RIPA),一、免疫滲濾測(cè)定(IFA),,IFA——雙抗體夾

9、心法測(cè)抗原,IFA——結(jié)果判斷,二、免疫層析測(cè)定（ ICA ）,,ICA 試劑條,樣品墊,結(jié)合物墊,NC膜,吸水墊,,ICA——雙抗體夾心法測(cè)抗原,,,,,,,,,,,,,,,,,ICA——間接法測(cè)抗體,,,,,,ICA 結(jié)果觀察,,,陽(yáng)性,陰性,無(wú)效,,,,,,,,,,,,,,IFA與ICA的比較,,IFA 穿流（FLOW THROUGH）ICA 橫流（LATERAL FLOW）,GIFA技術(shù)的發(fā)展

10、（間接法測(cè)抗體）,GIFA技術(shù)的發(fā)展,,,ICA技術(shù)的發(fā)展,1990年 ABBOTT公司 膠體硒標(biāo)記ICA Unipath公司 CLEARVIEW 立明衣原體 彩色膠乳標(biāo)記ICA ROCHE Cardiac Reader TnT 定量 0.1~3 ng/ml

11、 合成TnT質(zhì)控點(diǎn),,,S,C,,,TC2 C1,,,,,,,測(cè)定線,對(duì)照線,,,半定量測(cè)定,三、斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn) ——Dot-ELISA,四、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)—— ELISPOT,20世紀(jì)80年代，國(guó)外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測(cè)特異性抗體分泌B細(xì)胞和細(xì)胞因子分泌T細(xì)胞的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzyme linked immunospot , ELISPOT)。,E

12、LISPOT 檢測(cè)原理,細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后， 被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過(guò) CTL 公司生產(chǎn)的 ELISPOT 酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果。,ELISPOT 分析儀解決以下問(wèn)題,哪些斑點(diǎn)是抗原特異性 T 細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點(diǎn)具有進(jìn)一

13、步分析價(jià)值），哪些是無(wú)關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點(diǎn)沒(méi)有 T 細(xì)胞研究?jī)r(jià)值） 斑點(diǎn)大小的意義 在對(duì)不同細(xì)胞因子計(jì)數(shù)和分析時(shí)，如何定義斑點(diǎn)最大和最小尺寸 如何從單個(gè)細(xì)胞基礎(chǔ)上分析 實(shí)驗(yàn)精確度有多高？如果一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生相似的細(xì)胞因子，在多大程度上會(huì)干擾分析結(jié)果？ 幾次重復(fù)實(shí)驗(yàn)才能使結(jié)果更有意義？,ELISAPOT,ELISPOT結(jié)果判斷,方法學(xué)評(píng)價(jià),五、免疫印跡法——Westernblot法,原理,Westernblot——抗原表位可能被破壞

14、而漏檢,六、放射免疫沉淀試驗(yàn),原理,放射免疫沉淀試驗(yàn)——抗原表位不會(huì)破壞,思考題,1. 敘述固相膜免疫測(cè)定概念。2．膜的種類與特性是什么？3．膜載體免疫測(cè)定的種類有哪些？4．斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)(dot immunogold filtration assay, DIGFA)的原理是什么？5．免疫層析試驗(yàn)（immunochromatography assay, ICA）的原理是什么？,,6．斑點(diǎn)ELISA (dot enzyme

15、 linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 原理是什么？7．酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 原理是什么？8．免疫印跡法(immunoblotting test, IBT) 原理是什么？9．免疫印跡法(immunoblotting test, IBT) 注意事項(xiàng)是什么？10．放射免疫沉淀試驗(yàn)(radioimmunoprecipitatio