腫瘤基因治療的基本策略和常用方法

1、腫瘤基因治療的基本策略和常用方法,臨五1604 張湘鈺 鄒穎,CONTENTS,腫瘤基因治療的基本策略和常用方法,01,腫瘤和基因治療的基本概念,01 腫瘤,機(jī)體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個(gè)細(xì)胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的異常病變。學(xué)界一般將腫瘤分為良性和惡性兩大類。,01 基因治療,指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的，腫瘤的基因治療是將目

2、的基因?qū)氚屑?xì)胞,使其在體內(nèi)表達(dá)并發(fā)揮特定的功能,殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞從而達(dá)到治療的目的,02,腫瘤基因治療的基本策略,,,,,01,02,03,04,采用基因打靶技術(shù)矯正突變的抑癌基因中的突變序列,將外源性的正常抑癌基因直接導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，取代突變的抑癌基因而發(fā)揮作用，以改變腫瘤細(xì)胞的惡性表型,利用基因干擾技術(shù)等抑制異常表達(dá)的癌基因或腫瘤相關(guān)基因，降低其表達(dá)活性或使其不表達(dá),基因失活,又稱基因轉(zhuǎn)移，是指將外源性目的基因?qū)氚┳兗?xì)胞，通過目

3、的基因表達(dá)產(chǎn)物修飾缺陷細(xì)胞，使其恢復(fù)功能或原有功能得到加強(qiáng)基因型修飾是應(yīng)用最廣泛的一個(gè)策略。,03,常用方法,,,1、基因干預(yù)技術(shù),（1）反義RNA技術(shù) 如何獲得反義RNA： ① 體外構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體，將其導(dǎo)入腫瘤 細(xì)胞并表達(dá)反義RNA

4、 ② 體外合成反義RNA，將其導(dǎo)入靶細(xì)胞，對表 達(dá)異常的癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制效應(yīng)。,1、基因干預(yù)技術(shù),反義RNA技術(shù)在基因治療中需解決的首要問題： ① 專一性轉(zhuǎn)移問題 ：如何專一性的對病灶處病變的細(xì)胞進(jìn)行處

5、 理，而不影響其它正常細(xì)胞 ② 反義RNA在進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問題：反義RNA抗RNase的 能力不強(qiáng)

6、 ③ 安全性問題,1、基因干預(yù)技術(shù),受體介導(dǎo)反義RNA轉(zhuǎn)移技術(shù) 受體介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬作用：細(xì)胞膜上存在一些專一性受體是組織或器官特異的，這些受體專一性的與相應(yīng)配體結(jié)合后，所形成的受體配體復(fù)合物就會在細(xì)胞膜上某些特定區(qū)域富集，通過細(xì)胞吞噬作用，實(shí)現(xiàn)這些配體向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移 特點(diǎn)：①具有細(xì)胞、組織或器官專一性，配體

7、 只能被一些特異的細(xì)胞吞噬 ②配體進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)移效率很高,,脫唾液酸血清類黏蛋白（ASGP）受體介導(dǎo)反義RNA轉(zhuǎn)移,1、基因干預(yù)技術(shù),反義DNA技術(shù)治療腫瘤的三個(gè)設(shè)想： ① 封閉異常表達(dá)的癌基因 ② 癌基因的異位和重排部位

8、是反義RNA治療的理想目標(biāo) ③ 抑制腫瘤細(xì)胞耐藥性，從而提高化學(xué)治療效果,1、基因干預(yù)技術(shù),⑵、RNA干擾技術(shù),RNA干擾( RNA interference,RNAi ) 是指在進(jìn)化過程中高度保守的,由雙鏈RNA ( dsRNA) 誘發(fā)、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。RNAi使特定基因沉默,是真核細(xì)胞中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制,這種由21 ~ 23 個(gè)核苷酸長

9、度介導(dǎo)的小RNA常被稱為小干擾RNA( siRNA) ,其序列在真核生物進(jìn)化中高度保守。將長dsRNA或短siRNA遞送進(jìn)入生物體細(xì)胞內(nèi)均可引發(fā)RNA i，進(jìn)而使特定基因表達(dá)沉默,基于RNAi的腫瘤治療應(yīng)用于臨床,有兩個(gè)關(guān)鍵問題亟需解決: 首先,如何高效向腫瘤細(xì)胞或組織遞送干擾RNA; 其次,如何減少外源性siRNA引起的不良反應(yīng)。,1、基因干預(yù)技術(shù),RNAi 作用機(jī)制①病毒基因、轉(zhuǎn)座子、人工轉(zhuǎn)入基因等外源基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組

10、內(nèi),并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)常產(chǎn)生一些dsRNA 。② siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈,然后由反義鏈與胞內(nèi)一些酶( 包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等) 結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物 （RISC）③此時(shí)RISC具有核酸酶的功能,能在結(jié)合部位切割mRNA,切割位點(diǎn)是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解,進(jìn)而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對這些mRNA的降解反應(yīng),1、基因干預(yù)技術(shù),RNAi理想遞送系

11、統(tǒng) ① 適配體——RNAi的嵌合體。適配體能與多種目標(biāo)物質(zhì)高特異性、高選擇性結(jié)合② 穩(wěn)定核酸脂質(zhì)復(fù)合物（SNALPs），對脂類復(fù)合物進(jìn)行聚乙二醇（PEG）修飾使得復(fù)合物獲得親水性外層，從而增強(qiáng)其在血漿中的穩(wěn)定性,如何高效地向腫瘤細(xì)胞或組織遞送干擾RNA,?,1、基因干預(yù)治療,如何解決RNAi存在的安全問題,?,1、克服siRNA的脫靶問題 siRNA可引起一些非靶基因的特異性沉默或表達(dá)上調(diào)，引起細(xì)胞凋亡或生長抑

12、制，這種現(xiàn)象叫做脫靶效應(yīng) 解決脫靶效應(yīng)的潛在方法： ⑴ 最新發(fā)現(xiàn)的siRNA領(lǐng)域轉(zhuǎn)移優(yōu)化策略 ⑵ 改變siRNA濃度 ⑶ siRNA設(shè)計(jì)2、克服RNAi引起的免疫反應(yīng) siRNAs是哺乳動(dòng)物固有免疫系統(tǒng)的有力激活劑

13、，能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素。 解決方法： ⑴ 用免疫刺激的siRNA來避免誘發(fā)的相關(guān)免疫反應(yīng)，通過選擇免疫缺乏刺激基序的序列，設(shè)計(jì)出無免疫刺激活性的siRNA ⑵通過化學(xué)修飾來穩(wěn)定siRNA,2、自殺基因治療,,基本原理：向腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入某些真核細(xì)胞中不存在的酶基因，這些基因表達(dá)的特異性酶可以催化對真核細(xì)胞無毒或低毒的藥物前提，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸种坪怂岷铣尚?yīng)的

14、抗代謝藥物，進(jìn)而選擇性的地使轉(zhuǎn)染了該基因的腫瘤細(xì)胞“自殺”。旁觀者效應(yīng)：導(dǎo)入有自殺基因的腫瘤細(xì)胞對鄰近的未導(dǎo)入自殺基因的腫瘤細(xì)胞有殺傷作用。可明顯擴(kuò)大自殺基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的殺傷作用,基本步驟： ⑴ 尋找具有治療意義的目的基因 ⑵ 建立向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移目的基因的載體系統(tǒng) ⑶ 目的基因在靶細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，達(dá)到治療目的

15、,2、自殺基因治療,⑴、常見的自殺基因系統(tǒng)① tk-GCV系統(tǒng)病毒、細(xì)菌、真核細(xì)胞中都存在胸苷激酶（HSV-tk）。甘昔洛韋(GCV)是臨床上用于治療單純皰疹的藥物。GCV在胸苷激酶的作用下生成三磷酸GCV，能阻斷DNA合成產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。② CD-5-FC系統(tǒng)胞嘧啶脫氨酶基因(CD)存在于許多細(xì)菌和真菌中，5-氟胞嘧啶(5-FC)在微生物體內(nèi)被CD代謝 成5-氟尿嘧啶，后者有明顯的抗腫瘤活性。目前應(yīng)用最廣泛的是大腸桿菌的CD

16、基因。,2、自殺基因治療,⑵ 、自殺基因的轉(zhuǎn)導(dǎo) Ⅰ、載體技術(shù) ① 病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移：以其高轉(zhuǎn)染率和良好的靶向性成為腫瘤治療中應(yīng)用最廣泛的方法，其中包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒 ② 非病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移：常用的非病毒載體有脂質(zhì)體及多聚陽離子聚合物，具有低免疫、低毒性、無基因插片段大小限制等優(yōu)勢，但缺乏組織的特異性和靶向性，轉(zhuǎn)染效率低且易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，基因表達(dá)時(shí)間,2、自殺基因治療,Ⅱ、增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

17、 自殺基因治療要求轉(zhuǎn)染的自殺基因要有一定的表達(dá)效率，同時(shí)能選擇性的表達(dá)于靶細(xì)胞中，從而最大限度的殺傷腫瘤細(xì)胞。目前主要的靶向方法有： ① 靶向性轉(zhuǎn)導(dǎo) 載體攜帶外源基因, 在一定的反應(yīng)環(huán)境中作用于靶細(xì)胞, 完成基因轉(zhuǎn)移這一過程中, 無論是載體、環(huán)境因素還是靶細(xì)胞的改變都將影響基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。 惡性腫瘤細(xì)胞常有表面受體的異常表達(dá)或腫瘤特異性抗原表達(dá), 將載體與腫瘤表面特異表達(dá)、高表達(dá)受體相對應(yīng)的配體或與相對應(yīng)抗體相連,

18、 將提高外源基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率 ② 靶向性轉(zhuǎn)錄 基因的表達(dá)受到多層次的調(diào)控, 因此外源基因的表達(dá)調(diào)控可以通過對多個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)來實(shí)現(xiàn)。在自殺基因前端接上腫瘤特異性的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件, 可以增強(qiáng)外源基因 在腫瘤中的特異性表達(dá), 以加強(qiáng)自殺基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的特異性殺傷效力, 同時(shí)可以降低它對正常細(xì)胞的毒性作用,3、免疫性基因治療,基本策略： 根據(jù)免疫學(xué)的理論和技術(shù)，并結(jié)合基因轉(zhuǎn)移和基因表達(dá)調(diào)控等分子生物學(xué)方法，以激發(fā)機(jī)體

19、腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細(xì)胞功能為目的的一種腫瘤基因治療方法，主要包括： 細(xì)胞因子基因治療和抗體抗原基因治療,3、免疫性基因治療,3.1 細(xì)胞因子基因治療,原理：細(xì)胞因子基因治療是應(yīng)用分子生物學(xué)方法 ,將與免疫有關(guān)的細(xì)胞因子編碼基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤或其他免疫效應(yīng)細(xì)胞 ,使其在機(jī)體表達(dá)，分泌細(xì)胞因子或利用其基因增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性或機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能 ,進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。,3、免疫性基因治療,3.1.1細(xì)胞因子基因?qū)朊庖咝?yīng)細(xì)胞,將細(xì)胞

20、因子基因?qū)肽[瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TILS)或腫瘤特異性殺傷細(xì)胞 ,再將這些轉(zhuǎn)基因免疫活性細(xì)胞回輸入荷瘤宿主,就能選擇性聚集在腫瘤組織中,產(chǎn)生細(xì)胞因子,提高局部細(xì)胞因子水平,使轉(zhuǎn)基因免疫活性細(xì)胞發(fā)揮較強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)。,3. 1 .2細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤細(xì)胞,在體外將編碼細(xì)胞因子的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞,經(jīng)γ射線等處理使失去致癌性,而保存分泌細(xì)胞因子能力,通過細(xì)胞因子生物學(xué)活性,誘導(dǎo)CTL(特異T細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性及抗體產(chǎn)生,增強(qiáng)抗腫

21、瘤免疫。,3、免疫基因治療,3.2 抗原抗體基因治療,3.2.1抗原基因治療原理：將抗原基因?qū)肽[瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫基因治療的設(shè)想，是鑒于許多臨床研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞缺乏主要組織相容性復(fù)合物（MHC）Ⅰ類或Ⅱ類分子的表達(dá)，導(dǎo)致不能將腫瘤抗原運(yùn)輸至細(xì)胞表面，也不能向T細(xì)胞提呈抗原，因而不會誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的CTL，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。 采用人MHCⅠ類基因HLA-B7進(jìn)行黑色素瘤基因治療，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)同種異體H

22、LA-B7基因，誘導(dǎo)特異性CTL參與的免疫效應(yīng)。,3、免疫性基因治療,3.2.2 抗體基因治療,原理：①抗體可以誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒反應(yīng)，本身具有一定的抗腫瘤效應(yīng)，可直接作用于某些癌基因異常表達(dá)所致的腫瘤。 曾有美國學(xué)者構(gòu)建了一種編碼單鏈抗體的載體 (PGT21)，將其轉(zhuǎn)染到CerB2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可以通過細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗CerB2單鏈抗體，抑制腫瘤的生長。,4、提高化學(xué)治療效果的輔助基因治療,4.1藥物增敏基因

23、治療： 原理：將某些藥物增敏基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，使其對抗腫瘤藥物的敏感 性大大增加。 將雞鈣調(diào)素(CaM)基因?qū)胄∈?乳腺癌細(xì)胞株C127后，應(yīng)用較低劑量的長春新堿或長春堿即可抑制該細(xì)胞株的生長。其原理是，CaM基因的表達(dá)產(chǎn)物作為 細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要物質(zhì)，可明顯增加腫瘤細(xì)胞對長春新堿和長春堿的吸收量而減少排泄量，從而提高了腫瘤細(xì)胞內(nèi)化學(xué)治療藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。,4、提

24、高化學(xué)治療效果的輔助基因治療,4.2耐藥基因治療,①腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生與多種糖蛋白有關(guān)，包括多藥耐藥基因編碼的P-糖蛋白，多藥耐藥相關(guān)蛋白等。為了降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性，可以開發(fā)爭對腫瘤細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生機(jī)制的拮抗劑，如阻斷P-糖蛋白所引發(fā)多藥耐藥的戊脈安。還可以采用基因干擾技術(shù)，在基因水平阻斷耐藥基因的表達(dá)，使腫瘤的多藥耐藥性消失。②針對化學(xué)治療所致的骨髓細(xì)胞造血功能受到抑制的問題，通過向腫瘤患者的骨髓細(xì)胞導(dǎo)入某種耐藥基因，如mdr-

25、1等基因，以增強(qiáng)骨髓細(xì)胞的抗藥性，以便能耐受大劑量的化學(xué)治療藥物，以達(dá)到徹底殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。,04,對未來腫瘤基因治療的展望,04 對未來腫瘤基因治療的展望,經(jīng)過近30年的發(fā)展,基因治療相關(guān)技術(shù)趨于成熟,若干關(guān)鍵技術(shù)獲得突破。因此,未來幾年將是全球基因治療產(chǎn)品上市的重點(diǎn)時(shí)期,但基因治療應(yīng)用于惡性腫瘤等重大疾病的治療還面臨一些挑戰(zhàn),展望未來基因治療的熱點(diǎn)和亟待解決的科學(xué)問題還有以下幾個(gè)方面,1、基因的體內(nèi)遞送問題

26、 基因的體內(nèi)遞送問題是腫瘤基因治療研發(fā)的熱點(diǎn)和重要科學(xué)問題，而如何將基因安全、高效地導(dǎo)入到腫瘤治療部位是基因治療的重要挑戰(zhàn)。目前，大多數(shù)的腫瘤基因治療缺乏靶向性，只能將表達(dá)載體導(dǎo)入到體表的腫瘤部位，使得治療只能局限于一些頭頸部腫瘤，即使有部分全身給藥的基因治療方案進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但由于缺乏腫瘤的靶向性或存在安全性等問題，使得基因難以安全、高效地到達(dá)腫瘤部位，最終導(dǎo)致療效不理想，甚至?xí)a(chǎn)生很大的毒性作用,2、基因治療的安全性問題

27、 安全性問題一直是基因治療的熱點(diǎn)問題。1999年兩例由于基因治療引發(fā)的醫(yī)療事故引起了人們對基因治療安全性問題的擔(dān)憂。目前，逆轉(zhuǎn)錄病毒使用越來越少，更多基因治療方案使用安全性更高的腺病毒、腺相關(guān)病毒等。為了提高基因治療的安全性，各國科學(xué)家和臨床醫(yī)生在不斷改進(jìn)技術(shù)和優(yōu)化臨床試驗(yàn)方案,3、基因檢測技術(shù)和基因治療相結(jié)合 隨著基因檢測技術(shù)、大規(guī)?；驕y序技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)等的不斷進(jìn)步，利用基因檢測技術(shù)可以更全面、準(zhǔn)確的描