生物化學酶促反應動力學

1、2006-1-7,上海大學生命科學學院,第九章 酶促反應動力學,一、化學動力學基礎,二、底物濃度對酶反應速率的影響,三、酶的抑制作用,四、溫度對酶反應速度的影響,五、pH對酶反應的影響,六、激活劑對酶反應的影響,2006-1-7,上海大學生命科學學院,一、化學動力學基礎,化學反應的兩個基本問題：（1）反應進行的方向、可能性和限度；（2）反應進行的速率和反應機制。,（一）反應速率及其測定,反應速率是以單位時間內反應物或生成物濃度的改變來

2、表示。用瞬時速率表示反應速率： v =dc/dt反應速率的測定實際上就是測定不同時間的反應物或生成物的濃度。,2006-1-7,上海大學生命科學學院,（二）反應分子數(shù)和反應級數(shù),1. 反應分子數(shù)：在反應中真正相互作用的分子的數(shù)目。單分子反應，雙分子反應，……判斷一個反應是單分子反應還是雙分子反應，應先了解反應機制，即反應過程中各個單元反應是如何進行的。

3、,2. 反應級數(shù)：根據(jù)實驗結果，整個化學反應的速率服從哪種分子反應速率方程式，則這個反應即為幾級反應。一級反應，二級反應，……，零級反應。,2006-1-7,上海大學生命科學學院,（三）各級反應的特征,1. 一級反應凡是反應速率只與反應物的濃度的一次方成正比的，這種反應就稱為一級反應。速率常數(shù)與半衰期成反比，半衰期與反應物的初濃度無關。2. 二級反應凡是反應速率與反應物濃度二次方（或兩種物質濃度的乘積）成正比的，這種反應就稱為

4、二級反應。半衰期與初濃度成反比。3. 零級反應凡是反應速率與反應物濃度無關而受它種因素影響而改變的反應。半衰期與初始濃度成正比。,2006-1-7,上海大學生命科學學院,二、底物濃度對酶反應速率的影響,（一）中間絡合物學說,1903年，Henri用蔗糖酶水解蔗糖的實驗,在低底物濃度時, 反應速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級反應特征。隨著底物濃度的增加, 反應速度不再按正比升高，反應表現(xiàn)為混合級反應。當?shù)孜餄舛冗_到一定值，反應

5、速度達到最大值（Vmax），此時再增加底物濃度，反應速度不再增加，表現(xiàn)為零級反應。,2006-1-7,上海大學生命科學學院,酶與底物的中間絡合物學說（Henri和Wurtz）,S+E ES P+E,,中間產(chǎn)物假說證據(jù)： （1）ES復合物已被電子顯微鏡和X射線晶體結構分析直接觀察到。（2）酶和底物的光譜特性在形成ES后發(fā)生變化。（3）酶的物理性質經(jīng)常在形成ES后發(fā)生變化。（4）已分離得到ES復合

6、物。（5）平衡透析時，底物濃度在半透膜內外不等。,（二）酶促反應的動力學方程式,1.米氏方程式的推導,推導原則：從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā)，按照 “穩(wěn)態(tài)平衡”假說的設想進行推導。,米氏方程:,米氏常數(shù):,米氏方程的推導,令：,將（4）代入（3），則：,[ES]生成速度：,，[ES]分解速度：,即：,則：,由于酶促反應速度由[ES]決定，即,將（2）代入（1）得：,(3),當酶反應體系處于

7、恒態(tài)時：,當[Et]=[ES]時，,酶反應速度與底物濃度的關系曲線,當[S] <<Km時,當[S]＞＞Km時,當[S]=Km時,本條件可準確測定酶活力,Km的物理意義,2006-1-7,上海大學生命科學學院,2.動力學參數(shù)的意義,（1）米氏常數(shù)的意義,a.不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個重要的特征物理常數(shù),只與酶的性質有關，而與其濃度無關。b.Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不

8、同條件下具有不同的Km值。c.Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。（同一種酶有幾種底物就有幾個Km值，其中Km值最小的底物一般稱為該酶的最適底物或天然底物） 一般情況下，1/Km可以近似地表示酶對底物的親和力大小， 1/Km愈大，表明親和力愈大。,所以1/Km表示形成ES的趨勢大小,特例： Km=K2/K1=Ks(在K3??K1，K2時),d.

9、Km與Ks Km不等于Ks。在K3<<K1、K2時， Km看作Ks，也只有此時1/Km 才可以近似表示酶與底物結合的難易程度。 e. Km與Km? 無抑制劑時，ES的分解速度與形成速度的比值符合米氏方程，為Km; 而有抑制劑時發(fā)生變化，則不符合米氏方程，為Km? 。,2006-1-7,上海大學生命科學學院,f.Km和米氏方程的實際應用 若已知某個酶的Km值，可以計算在某一個底物濃度時，反應速度相當于最大反應速度的百

10、分率。g.Km可以幫助推斷某一反應的方向和途徑,2006-1-7,上海大學生命科學學院,（2）Vmax和k3(kcat)的意義,在一定的酶濃度下，Vmax是一個常數(shù)，它只與底物的種類及反應條件有關。,當[S]很大時，Vmax=K3 [E],K3代表酶被底物飽和時每秒鐘每個酶分子轉換底物的分子數(shù)，稱為轉換數(shù)（或催化常數(shù)，Kcat）， 表明酶的最大催化效率。,轉換數(shù)的倒數(shù)即為催化周期：一個酶分子每催化一個底物分子所需的時間。乳糖脫氫酶轉

11、換數(shù)為1000/秒，則它的催化周期為10-3秒,（3） Kcat/Km 的意義,在生理條件下， [S]/Km=0.01～1.0,[S]<<Km 時：,Kcat/Km的上限是K1，即生成ES復合物的速度(酶促反應的速度不會超過ES的形成速度K1，在水相中不會超過108～109）,衡量酶催化效率的參數(shù)：即其大小可以比較不同酶或同一種酶催化不同底物的催化效率,2006-1-7,上海大學生命科學學院,只有Kcat/Km可以客觀地比較

12、不同的酶或同一種酶催化不同底物的催化效率,2006-1-7,上海大學生命科學學院,3.利用作圖法測定Km和Vmax值,（1） Lineweaver-Burk  雙倒數(shù)作圖法米氏方程的雙倒數(shù)形式：,基本原則：將米氏方程變化成相當于y=ax+b的直線方程，再用作圖法求出Km。,1 Km 1 1 — = —— . — + ——

13、 v Vmax [S] Vmax,2006-1-7,上海大學生命科學學院,（2） Eadie-Hofstee 作圖法,v～v/[S]作圖法,,,,v,,Vmax,,-Km,2006-1-7,上海大學生命科學學院,（3） Hanes-Woolf 作圖法,1 Km 1 1 — = —

14、— . — + —— v Vmax [S] Vmax,在,兩邊均乘以[S]：,以 ～[S]作圖,,,,,,-Km,,[S],（4）Eisenthal 作圖法,（5）Hill 作圖法,（寡聚酶）,2006-1-7,上海大學生命科學學院,（三）多底物的酶促反應,1.多底物酶促反應按動力學機制分類,①有序反應,只有Leading substrate (領先底物A)首

15、先與酶結合，然后B才能與酶結合，形成的三元復合物EAB（ternary complex)轉變?yōu)镋PQ，B 的產(chǎn)物P先釋放，A的產(chǎn)物Q后釋放。★在缺少A時，B不能與E結合,E+A+B→AEB→PEQ→E+P+Q,（1）序列反應,2006-1-7,上海大學生命科學學院,A與其產(chǎn)物Q相互競爭地結合E，但A和B互不竟爭反應的總方向決定于A、Q的濃度和反應的平衡常數(shù),NAD＋ 與NADH相互競爭E上的NAD＋結合部位,②隨機反應,底物A、B

16、與酶結合的順序是隨機的，形成的三元復合物AEB → QEP，產(chǎn)物P、Q的釋放順序也是隨機的。,限速步驟是AEB → QEPA與Q相互競爭E上的底物結合部位A，B 與P相互競爭E上的底物結合部位B反應的總方向決定于A、B、Q、P的濃度和反應的平衡常數(shù),（2）乒乓反應,底物A先與E結合成AE二元復合物，AE → PF（修飾酶形式），釋放第一個產(chǎn)物P，接著底物B與F形成FB，F(xiàn)B →EQ，釋放第二個產(chǎn)物Q。A與Q 競爭自由酶形式E ，B

17、與P競爭修飾酶形式F。整個反應歷程中只有二元復合物形式，沒有三元復合物形式。,2.雙底物反應的動力學方程,（1）乒乓機制的動力學方程,KmA： [B]達到飽和濃度時A的米氏常數(shù)KmA′： A的表觀米氏常數(shù)Vmax：[A][B]都達到飽和濃度時的最大反應速度,2006-1-7,上海大學生命科學學院,★乒乓機制的動力學曲線是兩組平行直線★表觀米氏常數(shù)KmA′（KmB′）隨[B]（ [A]）濃度的增大而增大★表觀最大反應速度Vmax

18、′隨[B]（[A]）的增大而增大,（2）序列機制的底物動力學方程,2006-1-7,上海大學生命科學學院,★序列機制的動力學曲線是兩組相交直線（交于X軸負側）★交點在X軸：表觀KmA′（KmB′）不隨[[B]（[A]）濃度變化而變化（ KmA′= KmA 、 KmB′= KmB）★交點在X軸上：表觀KmA′（KmB′）隨[[B]（[A]）濃度的增加而減小★交點在X軸下：表觀KmA′（KmB′）隨[[B]（[A]）濃度的增加而增

19、大★表觀最大反應速度Vmax′隨[B]（[A]）的增大而增大,2006-1-7,上海大學生命科學學院,三、酶的抑制作用,變性作用(denaturation)：抑制作用(inhibiton)：使酶活力下降或喪失但并不引起酶蛋白變性變性劑沒有選擇性抑制劑有不同程度的選擇性研究抑制劑對酶的作用有重大的意義：（1）藥物作用機理和抑制劑型藥物的設計與開發(fā)（2）了解生物體的代謝途徑，進行人為調控或代謝控制發(fā)酵（3）通過抑制劑試驗

20、研究酶活性中心的構象及其化學功能基團，不僅可以設計藥物，而且也是酶工程和化學修飾酶、酶工業(yè)的基礎,2006-1-7,上海大學生命科學學院,,,（一）抑制程度的兩種表示方法,1、相對活力,★相對活力分數(shù) (殘余活力),★相對活力百分數(shù)*100%,2、抑制率,★抑制分數(shù) （被抑制活力）,★抑制百分數(shù),2006-1-7,上海大學生命科學學院,（二）抑制作用的類型,1、不可逆的抑制作用抑制劑與酶活性中心（外）的必需基團共價結合，使酶

21、的活性下降，無法用透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復活。,2、可逆的抑制作用 抑制劑與酶蛋白非共價鍵結合，可以用透折、超濾等物理方法除去抑制劑而使 酶復活。,2006-1-7,上海大學生命科學學院,（1）競爭性抑制（Competitive inhibition） 抑制劑具有與底物類似的結構，競爭酶的活性中心，并與酶形成可逆的EI復合物，阻止底物與酶結合?？梢酝ㄟ^增加底物濃度而解除此種抑制。,2006-1-7,上海大學

22、生命科學學院,（2）非競爭性抑制（noncompetitive inhibition）底物和抑制劑可以同時與酶結合，但是，中間的三元復合物ESI不能進一步分解為產(chǎn)物，因此，酶的活性降低。抑制劑與酶活性中心以外的基團結合，其結構可能與底物無關。不能通過增加底物濃度的辦法來消除非競爭性抑制作用。,2006-1-7,上海大學生命科學學院,（3）反競爭性抑制酶只有在與底物結合后，才能與抑制劑結合。E+S→ES+I →ESI≠ P常見于

23、多底物的酶促反應中,2006-1-7,上海大學生命科學學院,（三）可逆抑制作用與不可逆抑制作用的鑒別,1、通過透析、超濾、凝膠過濾等2、通過v-E速度曲線,,,[E],v,,1,,2,,3,(1) 反應體系中不加I。,(2) 反應體系中加入一定量的不可逆抑制劑。,(3)反應體系中加入一定量的可逆抑制劑。,2006-1-7,上海大學生命科學學院,,,,,,[I ]增高→,,,,,,[I ]增高,,3、通過可逆抑制劑的動力學曲線可以區(qū)分三

24、種可逆抑制作用,（四）可逆抑制作用動力學,1、競爭性抑制,動力學方程：,（Ki為EI的解離常數(shù)）,★Vmax不變; Km變大，而且隨[I]濃度的增大而增大。,相對活力：,抑制分數(shù)：,★抑制程度決定于[I]、[S]、Km和Ki,2、非競爭性抑制,動力學方程：,,,★Km不變，Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki）,相對活力：,抑制分數(shù)：,★抑制程度決定于[I]和Ki ，與底物的Km和[S]無關,3、反競爭性抑制,動力學方程：,,★Km

25、及Vmax都變小,相對活力：,抑制分數(shù)：,★抑制程度決定于Km、Ki、[S]、[I],2006-1-7,上海大學生命科學學院,可逆抑制的動力學比較,抑制類型 Vmax變化 Km變化無抑制劑 / /競爭性抑制作用 不變 變大非競爭性抑制作用 變小 不變 反競爭性抑制作用 變小 變小,2

26、006-1-7,上海大學生命科學學院,（五）一些重要的抑制劑,1、不可逆抑制劑：,（1）非專一性不可逆抑制劑 與酶的活性中心以及活性中心外的某一類或幾類必需基團反應,①有機磷的?；锒惐柞７―FP，神經(jīng)毒氣）和許多有機磷農(nóng)藥。抑制機理：與蛋白酶及酯酶活性中心Ser的—OH形成磷脂鍵。毒理：強烈抑制乙酰膽堿脂酶（神經(jīng)毒劑）。  解毒劑：PAM（解磷定）可以把酶上的磷?；鶊F除去。,2006-1-7,

27、上海大學生命科學學院,②有機汞、有機砷化合物抑制機理：使酶的巰基烷化毒理：主要與還原型硫辛酸輔酶反應，抑制丙酮酸氧化酶系統(tǒng)。解毒劑：二巰基丙醇（BAL）、Cys、GSH等過量的巰基化合物。,2006-1-7,上海大學生命科學學院,③重金屬 Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多數(shù)酶失活，EDTA可解除。④、烷化物★含鹵素的烷化物（碘乙酸、碘乙酰胺、鹵乙酰苯等）常用于鑒定酶中巰基。⑤氰化物、硫化物、CO與含鐵卟啉的

28、酶中的Fe2+結合，阻抑細胞呼吸,2006-1-7,上海大學生命科學學院,⑥青霉素不可逆抑制糖肽轉肽酶⑦還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇等巰基試劑還原酶的二硫鍵、含活潑雙鍵試劑（與—ＳＨ、—ＮＨ２反應）Ｎ—乙基順丁烯二酰亞胺 ⑧親電試劑四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。,2006-1-7,上海大學生命科學學院,（2） 專一性不可逆抑制劑此類抑制劑僅僅和某一種酶的活性部位的必需基團反應。,①Ks型不可逆抑制劑（親

29、和標記試劑，親和修飾試劑）具有與底物相似的結構，同時還帶有一個能與酶活性中心或活性中心外的必需基團進行化學反應的活潑基團。專一性程度取決于它與活性中心及活性中心外的的Ks之比。胰乳蛋白酶的最佳底物：對-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯Ks型不可逆抑制劑：對－甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷（TPCK）-CH2-Cl與酶活性部位的一個His-咪唑基距離很近，很易使之烷基化。,2006-1-7,上海大學生命科學學院,② Kcat型不可逆抑

30、制劑（自殺性底物）具有與底物相似的結構，不僅能與酶結合，而且潛伏的反應基團（latent reactive group）能被酶催化而活化，并與酶活性中心必需基團進行不可逆結合。,2006-1-7,上海大學生命科學學院,2、可逆抑制劑,★競爭性抑制劑 許多代謝類似物都是競爭性抑制劑，可用作抗菌藥和抗癌藥物?！锘前奉愃幬锛捌渥饔脵C理對氨基苯磺酰胺或其衍生物對氨基苯甲酸的結構類似物，競爭性抑制細菌的二氫葉酸合成酶

31、活性,2006-1-7,上海大學生命科學學院,★抑制劑與藥物開發(fā)Kcat型不可逆抑制劑的專一性程度很強，前景廣闊底物類似物型的競爭性抑制劑最易開發(fā)過度態(tài)底物類似物型藥物最具價值(高效\特異),2006-1-7,上海大學生命科學學院,,四、溫度對酶促反應速度的影響,（一）最適溫度及影響因素 溫度對酶促反應速度的影響有兩個方面： ①提高溫度，加快反應速度。②提高溫度，酶變性失活。 溫度系數(shù)Q10：溫度升高

32、10℃，反應速度與原來的反應速度之比，大多數(shù)酶的Q10一般為1～2。溫血動物的酶，最適溫度35℃～40℃，植物酶最適溫度40℃～50℃，細菌Taq DNA聚合酶70℃。最適溫度不是酶的特征常數(shù)，它與底物種類、作用時間、pH、離子強度 等因素有關。,2006-1-7,上海大學生命科學學院,（二）酶的穩(wěn)定性溫度在某一時間范圍內，酶活性不降低的最高溫度稱該酶的穩(wěn)定性溫度。 酶濃度高、不純、有底物、抑制劑和保護劑會使穩(wěn)定性

33、溫度增高。酶的保存：①液體酶制劑可以利用上述5種因素中的幾種，低溫短暫保存。②凍干粉可在低溫冰箱中較長期保存。,2006-1-7,上海大學生命科學學院,五、pH對酶促反應速度的影響,1. pH影響酶活力的因素①影響酶蛋白構象，過酸或過堿會使酶變性。②影響酶和底物分子解離狀態(tài)，尤其是酶活性中心的解離狀態(tài)，最終影響ES形成。③影響酶和底物分子中另外一些基團解離，這些基團的離子化狀態(tài)影響酶的專一性及活性中心構象。,2006

34、-1-7,上海大學生命科學學院,2．酶的最適pH和穩(wěn)定性pH最適pH：使酶促反應速度達到最大時的介質pH。 最適pH與底物種類、濃度及緩沖液成分有關。,★雖然大部分酶的pH—酶活曲線是鐘形，但也有半鐘形甚至直線形。,2006-1-7,上海大學生命科學學院,六、激活劑對酶促反應的影響,凡是能提高酶活性的物質，都稱為激活劑。1、無機離子的激活作用（1）金屬離子：K+ 、Na+、Mg2+ 、Zn2+、Fe2+ 、Ca2+

35、（2）陰離子：Cl-、Br-、PO43-（3）氫離子★不同的離子激活不同的酶。★不同離子之間有拮抗作用和可替代作用，如Na+與K+、Mg2+與Ca2+之間常常拮抗，但Mg2+與Zn2+?？商娲！锛せ顒┑臐舛纫m中，過高往往有抑制作用，1～50mM,2006-1-7,上海大學生命科學學院,2、簡單有機分子的激活作用①還原劑（如Cys、還原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有—SH的酶。②金屬螯合劑（EDTA）能去除酶中重