冰凍切片制作與染色過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題與處理

1、冰凍切片制作與染色過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題,,,夏春梅cmxia@fudan.edu.cn,,1,問(wèn)題思考,組織是否足夠新鮮？1w以內(nèi)？灌注固定液、洗液PH值、離子濃度是否合適？一抗是選擇途徑，滴度如何確定的？是否閱讀過(guò)DATASHEET? 保存，有效期，reactivity, Cross-Reactivity ？對(duì)該蛋白表達(dá)和分布有無(wú)預(yù)期的估計(jì)和了解?是否設(shè)了陽(yáng)性和陰性對(duì)照？是否排除了自發(fā)熒光？是不是判讀正確？,,2,,,一、

2、冰凍切片的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便，快速，用時(shí)短可以不需要對(duì)組織固定、脫水、透明、包埋組織變化不大能很好保存脂肪，類(lèi)脂能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類(lèi)對(duì)有機(jī)溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細(xì)胞膜表面抗原和水解酶保存較好。,缺點(diǎn)：不容易做連續(xù)切片組織不能過(guò)大-不容易凍結(jié)或者組織凍結(jié)不均不容易制作較薄的切片凍結(jié)過(guò)程中容易產(chǎn)生水的結(jié)晶而影響細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗原物質(zhì)的定位組織結(jié)構(gòu)不如石蠟切片清晰，但是滿足科研的要求,針對(duì)

3、其缺點(diǎn)要注意操作條件優(yōu)化，避免錯(cuò)誤,,,,3,二、切片制作過(guò)程中幾個(gè)關(guān)鍵步驟,1. 動(dòng)物取材2. 組織固定3. 切片制作4. 切片染色好的切片制作和染色成功的關(guān)鍵細(xì)節(jié)決定成敗固定、漂洗溶液PH值，成分；切片厚度、手感；抗體效價(jià)、特異性；切片孵育時(shí)間，濕度、溫度；切片判讀正確-反映真實(shí)的科學(xué)現(xiàn)象知識(shí)結(jié)構(gòu)背景組織學(xué)結(jié)構(gòu)的熟悉……認(rèn)識(shí)病理改變：炎細(xì)胞侵潤(rùn)、壞死、水腫、蛋白變性、纖維化、增生、凋亡……審美觀、拍照角度、

4、視野、曝光時(shí)間、對(duì)比度……,,,,4,常規(guī)HE染色特殊染色如：Masson(Thichrome staining)，油紅O，尼氏染色，臺(tái)盼藍(lán)（肥大細(xì)胞）染色免疫染色(immunol staining)免疫熒光(immunol fluorescence)免疫組化(immunol histochemistry),,,依據(jù)科學(xué)研究的需要選擇方法,,5,1. 動(dòng)物取材：一定要注意“平行性”,1 Control,6 Control,2

5、Control,3 Control,4 Control,5 Control,1 sham,6 sham,2 sham,3 sham,4 sham,5 sham,1 I/R,6 I/R,2 I/R,3 I/R,4 I/R,5 I/R,1 I/R+treatment,2 I/R+treatment,,,3 I/R+treatment,4 I/R+treatment,5 I/R+treatment,6 I/R+treatment,預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)早發(fā)

6、現(xiàn)趨勢(shì)而不被誤導(dǎo)，減少無(wú)效率的工作量減少不同組間baseline的影響，便于不同批次實(shí)驗(yàn)組間比較（背景，抗體效價(jià)，環(huán)境條件對(duì)染色影響）發(fā)表、修改文章圖的一致性,橫向,縱向,橫向“block”,,,,6,舉例：不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間和條件下同種一染色方法結(jié)果差異,A B C,Masson staining,,,

7、,7,2. 標(biāo)本固定應(yīng)充分,固定的標(biāo)準(zhǔn)切片冰晶少，細(xì)胞擠壓變形小，切片完整，染色清晰一般較多采用組織固定后再行切片浸入法和灌注法浸入法：活檢、手術(shù)標(biāo)本，不能進(jìn)行灌注的組織固定灌注法：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究固定劑種類(lèi)：醛類(lèi)、非醛類(lèi)、丙酮及醇類(lèi)中性緩沖液配制多種聚甲醛較為常用組織固定時(shí)固定液要有足夠的量(固定液是組織體積的8-10倍)保持一定時(shí)間，快速灌注固定后，相同的固定劑再固定2-4h（ 4℃冰箱）,,,,8,減少冰晶的形成,

8、公認(rèn)：未經(jīng)固定的組織切片冰晶較多固定后的組織切片仍然會(huì)有一定的冰晶，為防止冰晶的形成采取如下方法速凍法：將組織置入低溫環(huán)境，使組織驟然降溫利用高滲溶液吸收組織水分子：將組織置于20% —30%的蔗糖溶液中，置4攝氏度冰箱足夠時(shí)間（多長(zhǎng)時(shí)間? 判定？）,,,,9,3. 切片：組織新鮮非陳舊標(biāo)本是成敗首要因素,低溫恒冷箱冰凍切片法組織快速冷凍到一定的硬度(機(jī)器要預(yù)冷)選擇不同的冷凍度 根據(jù)不同的組織而定未經(jīng)固定的腦組織、肝組

9、織：-10- -15℃左右甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織：-15～20℃含脂肪組織，-25℃左右含大量的脂肪 -30℃,,,,10,保持切片的完整性,切片破碎不全、有缺損的常見(jiàn)原因固定不完全 溫度設(shè)置不當(dāng)組織塊過(guò)冷、過(guò)硬，則切片就容易破碎組織塊冷凍不夠，硬度和韌度達(dá)不到，切片也同樣易粘、易碎組織塊帶有皮膚、包膜、過(guò)大或冰晶過(guò)多切片刀鈍或較臟，切片出現(xiàn)刮痕，使切片不完整操作手法不當(dāng)，如速度不適宜,,,,11,防止切片卷縮,

10、常見(jiàn)原因切片刀鈍或粘有組織碎屑防卷板位置不正確或防卷板較臟靜電或者氣流作用防卷板溫度高、室溫高采取對(duì)策：保持防卷板干凈、平整、無(wú)缺損、無(wú)刮傷戴口罩，以避免呼出的氣流直接吹到防卷板切片時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)注意間隔一會(huì)兒，蓋上冷凍室蓋，降低防卷板溫度,,,,12,貼片中常見(jiàn)問(wèn)題及處理,載玻片粘不上切片準(zhǔn)備的載玻片溫度過(guò)低將載玻片置于常溫即可 貼片時(shí)切片易碎排除固定不充分等因素外貼片時(shí)應(yīng)注意動(dòng)作輕、穩(wěn)、準(zhǔn)根據(jù)切片大小，

11、選用筆尖軟硬適中、大小合適的毛筆,,,根本的解決方法：多觀察，多練習(xí)，熟能生巧,,13,貼片方式及標(biāo)記,,,,載玻片上標(biāo)記（鉛筆）組織類(lèi)型時(shí)間組別檢測(cè)抗原類(lèi)型同一載玻片上包括各個(gè)所有組染色齊性,L1 DRG,Con. TNBSLY ZD72882014.4.20TRPV1+CGRP,,,,,TNBS,Con.,ZD7288,LY,,L1 DRG,Con. TNBSLY ZD72882014.4.

12、20TRPV1+CGRP,,,,,TNBS,Con.,ZD7288,LY,,L1 DRG,Con. TNBSLY ZD72882014.4.20TRPV1+CGRP,,,,,TNBS,Con.,ZD7288,LY,,L1 DRG,Con. TNBSLY ZD72882014.4.20TRPV1+CGRP,,,,,TNBS,Con.,ZD7288,LY,1,2,3,4,,14,4. 染色：抗體孵育和選擇: 免

13、疫組化最關(guān)鍵環(huán)節(jié),,,試劑公司提供標(biāo)準(zhǔn)化的試劑附詳細(xì)的試劑說(shuō)明書(shū)（datasheet，特別強(qiáng)調(diào)！）包括抗體的來(lái)源免疫球蛋白的亞類(lèi)單抗或多抗交叉反應(yīng)使用稀釋度使用流程和注意事項(xiàng)洗滌時(shí)緩沖液的適宜離子強(qiáng)度和PH值等,,15,抗體分裝和保存,購(gòu)入的抗體分裝在多個(gè)安瓿中根據(jù)月需要量，大致每安瓿含5~20微升立即放置低溫冰箱內(nèi)貯存（-20℃以下）長(zhǎng)期保存在4℃冰箱內(nèi)會(huì)失效避免反復(fù)凍融抗體效價(jià)急劇下降而失效,,,,16

14、,工作抗體的確定,確定對(duì)于所要研究抗原的最敏感抗體已出版的文獻(xiàn)作為參考資料(IHC和WB抗體要注意區(qū)別)陽(yáng)性切片進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)檢測(cè)抗體的最佳工作濃度了解哪些組織表達(dá)這些抗原有助于確定陽(yáng)性染色，特別是當(dāng)細(xì)胞表達(dá)水平低時(shí)尤為重要,,,,17,三、 免疫組化結(jié)果分析,免疫組化結(jié)果的判斷原則：,1.必須設(shè)對(duì)照2.抗原表達(dá)必須在特定部位3.陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá),,,,18,1.實(shí)驗(yàn)分析的相關(guān)介紹,,陽(yáng)性對(duì)照：用已知抗原陽(yáng)性的

15、切片與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。對(duì)照切片呈陽(yáng)性結(jié)果，標(biāo)為陽(yáng)性對(duì)照。,,,,19,用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對(duì)照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，稱陰性對(duì)照陰性對(duì)照還應(yīng)包括空白對(duì)照：用PBS替代第一抗體替代對(duì)照：用與第一抗體來(lái)源的同一動(dòng)物前血清，來(lái)替代第一抗體吸收實(shí)驗(yàn)：用過(guò)量的已知相應(yīng)的純化抗原與第一抗體反應(yīng)，抗體結(jié)合點(diǎn)全部與抗原結(jié)合，這種被抗原吸收的抗體不能再與組織內(nèi)的抗原反應(yīng)抑制實(shí)驗(yàn)：待檢標(biāo)本先與未標(biāo)記的特異性抗體反應(yīng)后再與

16、標(biāo)記的特異性抗體染色,陰性對(duì)照：,,,,20,,2. 免疫組化染色實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組結(jié)果分析表,,,,21,,,只有6，7實(shí)驗(yàn)結(jié)果有意義1～5均因?qū)φ战M的結(jié)果已否定Ab的特異性或因IHC技術(shù)操作存在錯(cuò)誤等而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果失去意義必須重復(fù)實(shí)驗(yàn)或換用 Ab,,,,,22,陽(yáng)性染色特點(diǎn)定位：胞漿、胞核、胞膜、間質(zhì)有結(jié)構(gòu)性染色強(qiáng)度不同：顏色深淺不一非特異性染色 細(xì)胞與組織無(wú)區(qū)別彌散性均勻,3. 綜合評(píng)價(jià)特異性陽(yáng)性染色：,,,,23,優(yōu)秀

17、免疫組化切片: 信噪比高,,,,,,,,,,,A B C,假陽(yáng)性示范圖,,,*彌漫棕色或單一黃色的細(xì)胞染色可能是非特異性的,,25,4. 染色失敗的幾種表現(xiàn)：,(1)所染的全部切片均為陰性結(jié) 果，包括陽(yáng)性對(duì)照在內(nèi)。,染色失敗,,(2)所有切片均呈陽(yáng)性反應(yīng),(3)所有切片背景過(guò)深,(4)陽(yáng)性對(duì)照染色

18、良好，檢測(cè)的 陽(yáng)性標(biāo)本呈陰性反應(yīng),,,,26,,,,,,27,①切片在染色過(guò)程中抗體過(guò)濃，或干片了。,緩沖液PH值不準(zhǔn)確，洗滌不徹底。,使用已變色的顯色底物溶液，或顯色反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。,④抗體溫育的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。,⑤H2O2 濃度過(guò)高，顯色速度過(guò)快且粘 附劑太厚。,（2）所有切片呈陽(yáng)性反應(yīng)，其原因：,,,,28,,,,,29,（4）陽(yáng)性對(duì)照染色良好，檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)。,最常見(jiàn)的原因是：,標(biāo)本的固定和處理不當(dāng),,,,30,