羽衣甘藍DH系的建立與利用及子葉、下胚軸再生與遺傳轉化研究.pdf

1、羽衣甘藍（Brassica oleracea var．acephala）是十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種，由于其耐寒性極強，可忍受低溫霜凍，近年來，已成為我國冬春季的主栽觀賞植物。目前國內市場上羽衣甘藍品種大部分為進口，且價格較高。因此選育出性狀優(yōu)良的自交親本，建立一套完善的制種技術，培育出具有自主知識產權的羽衣甘藍品種具有重要的意義。本文主要以羽衣甘藍雜交育種為目的，利用小孢子培養(yǎng)、分子標記、雙列雜交和遺傳轉化等方法對羽衣甘藍DH系的

2、獲得、DH0和DH1代的遺傳多樣性、DH系與自交系的遺傳關系的評價、雜種優(yōu)勢的表現、分子標記對雜種優(yōu)勢的預測、遺傳轉化受體系統(tǒng)的建立等進行了系統(tǒng)的研究。主要研究結果如下：
　　 1．建立了羽衣甘藍穩(wěn)定、高效的游離小孢子培養(yǎng)體系。詳細地研究了小孢子發(fā)育時期、取樣時期、基因型、培養(yǎng)條件等因素對小孢子胚胎發(fā)生的影響。結果表明，供試的37個基因型中，有20個獲得了胚狀體，占供試材料的54.1％，其中基因型‘桃舞’獲得了最高的出胚率，為1

3、23.6個/皿；自交系的出胚率比商業(yè)品種和F1代雜種的出胚率要低得多，且自交代數越高，小孢子的胚胎發(fā)生能力就越弱；在供試植株開花后3天取樣，選擇花蕾大小為3.0-4.0 mm的處于單核中期到雙核早期的的小孢子進行培養(yǎng)時胚胎發(fā)生能力最強；小孢子分離前，4℃低溫預處理48 h有利于部分基因型的小孢子胚胎發(fā)生，而對某些基因型有副作用；16％的蔗糖濃度最適合羽衣甘藍小孢子的胚胎發(fā)生，在熱激培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)基對小孢子的發(fā)育有副作用，而加液培

4、養(yǎng)能起到積極作用；向培養(yǎng)基中添加激素、活性炭和秋水仙素對小孢子的胚胎發(fā)生無促進作用。
　　 2．對小孢子胚狀體再生過程中基因型、基本培養(yǎng)基、瓊脂濃度、低溫處理、胚齡、激素等影響因素進行研究，從而建立遺傳穩(wěn)定的DH系。各不同基因型的小孢子植株再生率水平在20％-90％之間；附加1.0％的瓊脂的MS培養(yǎng)基最適合植株再生；低溫處理對胚狀體的再生有一定作用，但不明顯；25-30 d胚齡的胚狀體再生能力較強。MS+1.5 mg/L BA和

5、0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基有利于胚狀體再生成苗；被鑒定的3種基因型的小孢子植株的自然加倍率在38％-50％之間，95％以上的植株能夠很好的生根，移栽成活率在75％以上。無菌苗在培養(yǎng)基中進行秋水仙素加倍處理效果不佳，加倍率最高僅為16％。
　　 3．利用ISSR標記評價了羽衣甘藍DH0代及DH1代群體的遺傳多樣性。結果發(fā)現被評價的兩個DH0代群體均存在較大的遺傳多樣性，其中由P3小孢子培養(yǎng)得到的DH0群體比‘名古屋-紅’所得到

6、的DH0群體的基因型更豐富。‘名古屋-紅’的DH0群體46個株系間相似系數范圍為0.61-0.97；P3的DH0群體的41個株系間相似系數范圍為0.56-0.91。3個DH1代群體各株系間基本無遺傳差異，而作為對比的兩個自交系存在一定的遺傳差異，這表明由小孢子培養(yǎng)所得的植株經過自交后的DH1代各株系基因型是完全純合的，而自交6代的自交系在遺傳上遠未達到純合。
　　 4．為了正確地選擇羽衣甘藍雜交育種的優(yōu)良親本，利用表型性狀、IS

7、SR、SRAP以及ISSR+RAP標記對羽衣甘藍DH系和自交系間進行了遺傳多樣性的評估。通過對11個表型性狀的分析，結果表明外觀特征（株型和葉色）不是羽衣甘藍表型性狀分類的重要指標，而株高、外葉數及開展度、心葉數及開展度能很好地鑒別羽衣甘藍純系聚類群。從38條ISSR引物和170對SRAP引物中篩選到具有多態(tài)性的ISSR和SRAP引物各9條。ISSR引物共擴增出80條帶，多態(tài)性位點數為68，多態(tài)性位點比率為85.0％，平均多樣性指數為0

8、.4055和有效等位基因數為1.4397；SRAP引物共擴增出84條帶，多態(tài)性位點數為70，多態(tài)性位點比率為83.3％，平均多樣性指數為0.4123，有效等位基因數為1.4687。ISSR與SRAP標記的聚類結果微弱相關（R=0.1645）：ISSR+SRAP的聚類結果與品系的系譜來源最為一致：形態(tài)標記和分子標記之間存在著一定的相關性，但是一致性并不高。其中SRAP標記與形態(tài)標記的結果相關性最高，相關系數為0.4058，其次為ISSR+

9、SRAP，ISSR標記與形態(tài)標記結果相差最遠，其相關系數僅為0.0467。
　　 5．選取羽衣甘藍7個純系作為親本進行雙列雜交，結果表明，各個性狀上都表現出較強的雜種優(yōu)勢。利用SRAP和ISSR+SPAP標記的羽衣甘藍品系間遺傳距離與各性狀的F1表現和雜種優(yōu)勢相關性均不顯著，而特殊配合力與心葉數的雜種優(yōu)勢呈顯著相關?；诜肿訕擞浀挠H本間遺傳距離難以有效地預測羽衣甘藍的雜種優(yōu)勢。
　　 6．通過羽衣甘藍無菌苗子葉和下胚軸建

10、立了高效的再生體系。子葉和下胚軸的再生能力主要受基因型、苗齡和培養(yǎng)基的影響。4 d苗齡的外植體培養(yǎng)在附加3 mg/LBA和0.1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上獲得了最高的再生率（子葉65.0％，下胚軸76.1％）和平均出芽數（子葉4.3，下胚軸8.2），其中下胚軸的再生能力比子葉強；4個被試基因型中以‘名古屋-紅’的再生能力最高；培養(yǎng)基中添加3.0 mg/L AgNO3對子葉和下胚軸的再生有促進作用：下胚軸切段的形態(tài)學下端比上端的芽分

11、化能力要強。MS+1.0 mg/L BA+0.05 mg/L NAA用于再生芽的增殖效果最好；經過ISSR分子標記檢測，4個基因型的再生植株均表現出較強的遺傳穩(wěn)定性。
　　 7．以羽衣甘藍子葉和下胚軸為受體，對根癌農桿菌介導的遺傳轉化條件進行了摸索。羽衣甘藍對卡那霉素（Km）反應較為敏感，最終確定轉化過程中的選擇壓力為10 mg/L；抑菌劑頭孢霉素（Cef）濃度定為300 mg/L，但其對外植體再生有抑制作用。侵染之前對外植體預