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1、<p>　　表面等離子共振的原理及在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 </p><p>　　精神衛(wèi)生研究所 張瀚迪 學(xué)號：10281335 </p><p>　　摘要：表面等離子共振技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的用于分析生物分子相互作用的一項技術(shù)，它利用全反射時入射光可以和金屬表面的等離子發(fā)生共振的原理，探測生物分子之間是否發(fā)生作用以及反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)。該技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物

2、篩選、蛋白質(zhì)與核酸相互作用等各個領(lǐng)域，并獲得了許多用其它方法無法得到的動力學(xué)數(shù)據(jù)。 </p><p>　　導(dǎo)言：表面等離子共振技術(shù)是一項用于分析生物大分子之間的相互作用的技術(shù)，它可以定性的判斷兩分子之間是否有相互作用，比較一種分子與其他幾種分子之間相互作用的強弱，也可以實時定量的測定分子間相互作用的親和力參數(shù)（平衡常數(shù)）和動力學(xué)參數(shù)（速率常數(shù)），甚至熱力學(xué)參數(shù)（反應(yīng)的焓）。該技術(shù)是利用了物理光學(xué)的原理（下文詳述）

3、，在研究兩分子相互作用時，將一種分子固定在傳感片表面，而另一種分子的溶液流過其表面，兩種分子的結(jié)合會使傳感片表面的折射率改變，因此檢測兩分子間的相互作用。1983年，瑞典LINKOPING理工學(xué)院應(yīng)用物理實驗室Liedberg等人首先把它用于IgG與其抗原相互作用的檢測[1]，并由BIAcore公司開發(fā)出SPR傳感器。此后SPR傳感器的研究與改進迅速發(fā)展，其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用也日益廣泛。 </p><p>　　表

4、面等離子共振技術(shù)的基本物理光學(xué)原理：如果光波從光密介質(zhì)（折射率大）射向光疏介質(zhì)（折射率小），比如由玻璃射向空氣，且入射角大于臨界角時，沒有折射光產(chǎn)生，入射光全部反射回去，這一現(xiàn)象稱為全反射。全反射時光波在兩介質(zhì)分界面的行為是什么樣的呢？深入研究指出，全反射時光波將透入第二介質(zhì)（光疏介質(zhì)）很薄的一層表面（深度約為光波的波長），并沿界面流動約半個波長再返回第一介質(zhì)（光密介質(zhì)）。透入第二介質(zhì)的光波稱為倏逝波。如Fig 1 所示。</p&

5、gt;<p>　　倏逝波是一個沿x方向傳播的振幅在z方向（垂直于兩介質(zhì)界面的方向）按指數(shù)衰減的波。倏逝波最后仍返回第一介質(zhì)，總的來說光的能量沒有進入第二介質(zhì)。 </p><p>　　在兩介質(zhì)的界面鍍上一層很薄的金屬薄膜，薄膜厚度在倏逝波進入第二介質(zhì)深度之內(nèi)。當(dāng)一束單頻線偏振光以大于全反射臨界角的某一角度入射時，如果其頻率與金屬表面振蕩的自由電子（即等離子）頻率一致，則金屬表面的等離子就吸收入射光的能

6、量發(fā)生共振，這一現(xiàn)象就是表面等離子共振（surface plasmon resonance, SPR），此時的入射角稱為共振角。激發(fā)表面等離子共振的實質(zhì)在于光波以倏逝波的形式將能量轉(zhuǎn)移成表面等離子共振波，這時，反射光的強度和相位均發(fā)生劇烈變化[2]。如 Fig 2所示。 </p><p>　　Fig 2. 入射光（incident light）以入射角 θ 照 SPR 傳感器的工作原理： 根據(jù)這一原理研制了 SP

7、R 傳感器，其工作原理如 Fig3 所示。根 Fig 3 典型的 SPR 裝置圖。被分 析物——“配體”溶液流過固定 有‘受體’的傳感片表面，若發(fā) 生作用而相互結(jié)合則會引起表 面物質(zhì)質(zhì)量改變，而折射率與質(zhì) 在生物醫(yī)學(xué)研究中適合應(yīng)用 SPR 技術(shù)的工作有以下幾方面： 1、鑒定大分子 射到 玻璃（glass）與空氣（air）的界面，發(fā)生全反射，并產(chǎn)生倏勢波（evanescent wave）.玻璃表面鍍了一層很薄的金，由于入射光與金膜的表面等

8、離子（振蕩的表面自由電子）的頻率相匹配，因此發(fā)生共振，入射光能量被吸收，反射光能量降低，出現(xiàn)一吸收峰。 </p><p>　　根據(jù)這一原理研制了 SPR 傳感器，其工作原理如 Fig3 所示。根據(jù)檢測原理，共振角的變化就反應(yīng)了結(jié)合在傳感片表面的物質(zhì)質(zhì)量的變化。因此通過分析共振角，我們就可以分析分子之間的相互作用了。在SPR中，共振角的單位規(guī)定為RU，即反應(yīng)單位或共振單位，1RU=10-4度，根據(jù)測量的經(jīng)驗顯示，當(dāng)

9、有1ng/mm2的蛋白質(zhì)連接到表面時，約導(dǎo)致共振角增大1000RU。由于將分子直接固定到金膜表面很難達到有效的密度使檢測信號足夠強，因此發(fā)展了一種方法，即先在金表面鋪一層100-200nm厚的葡聚糖基質(zhì)，再將，兩種反應(yīng)分子中的一種作為“受體”固定在其表面，這樣大大提高了“受體”的密度，但也帶來一些不足，本文不詳細(xì)討論。</p><p>　　Fig 3 典型的 SPR 裝置圖。</p><p&g

10、t;　　被分 析物——“配體”溶液流過固定 有‘受體’的傳感片表面，若發(fā)生作用而相互結(jié)合則會引起表 面物質(zhì)質(zhì)量改變，而折射率與質(zhì)量成正比，所以折射率改變，欲保證SPR發(fā)生，共振角也得隨折射率改變，改變大小與結(jié)合的“配體”質(zhì)量成正比。反射光中的陰影表示有能量丟失，SPR儀器可以檢測到這一變化，并給出傳感圖。 左圖為共振角大小隨傳感片表面的分子質(zhì)量改變而從Ⅰ移到Ⅱ；右圖為實時監(jiān)測共振角的變化，隨時間延長，結(jié)合在表面的“配體”-“受體”復(fù)合物

11、增多，共振角也隨之增大。</p><p>　　在生物醫(yī)學(xué)研究中適合應(yīng)用 SPR 技術(shù)的工作有以下幾方面：</p><p>　　鑒定大分子：：許多實驗室需要生產(chǎn)重組蛋白，很重要的一項工作是確定重組蛋白與作為 模本的原始蛋白結(jié)構(gòu)保持一致，這可以通過驗證模本蛋白與原始蛋白的配體是否能夠結(jié)合來 2、平衡反應(yīng)的測量（測定反應(yīng)親和力與焓） 確定（酶蛋白除外）。配體可以是天然配體，也可以是單克隆抗體。S

12、PR儀器正適合這項工作。</p><p>　　平衡反應(yīng)的測量（測定反應(yīng)親和力與焓） 確定（酶蛋白除外）。配體可以是天然配體，也可以是單克隆抗體。SPR儀器正適合這項工作。 [3]（如 Fig 4） 親和力通常用結(jié)合常數(shù)（KA）或解離常數(shù)（KD）表示，多數(shù)人喜歡用 KD。測定親和力需要準(zhǔn)備一系列濃度的被測物，通過實時分析所得的數(shù)據(jù)，可以計算得到反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)或解離 常數(shù)。焓的測定：SPR 測定親和力具有很高的可信度

13、。根據(jù)這一點以及某些 SPR 儀器可以精 確控制溫度的特點，我們可以根據(jù) van’t Hoff analysis 規(guī)則計算反應(yīng)的焓。</p><p>　　動力學(xué)參數(shù)測量[3]</p><p>　　由于 SPR 儀器可以實時獲得數(shù)據(jù)，因此可以分析反應(yīng)動力學(xué)。然而，由于儀器本身的原因 動力學(xué)分析受到一定的限制。粗略來說，由于樣品輸送量的限制，SPR 儀器難于準(zhǔn)確測定 較高的結(jié)合速率常數(shù)Kon(

14、當(dāng)Kon>106M-1s-1時)，而由于其它原因解離速率常數(shù) Koff（當(dāng)K <10-5s-1 或 K >1s-1 時）不能準(zhǔn)確測得。</p><p>　　Fig 4. SPR傳感器的一次典型的分析過程?！芭潴w”固定在傳感片表面（經(jīng)適當(dāng)?shù)幕衔镄揎椀慕鸨∧け砻妫?，?秒時，緩沖液流入微流小室與傳感片接觸。在100秒時，“受體”溶液流入，“受體”—“配體”結(jié)合，傳感片表面分子質(zhì)量增加，使介質(zhì)折射率

15、升高，導(dǎo)致共振角增加。反應(yīng)達到平衡時，結(jié)合與解離速率相等，共振角升高的程度與“受體”的濃度正相關(guān)。若制備幾組已知濃度的“受體”，進行該分析過 程，則可計算得到平衡常數(shù)（Ka）。在 320 秒時，停止注入受體，流入緩沖液，“受體”—“配體”解離。Association 稱為連接相，Dissociation 稱為解離相，分析兩相數(shù)據(jù)，可以得到結(jié)合速率常數(shù)（Kon）和解離速率常數(shù)（Koff）。平衡常數(shù)也可以由速率常數(shù)計算得到（Ka= Koff

16、 / Kon）。在380秒時，加入NaOH洗去“表面分子”，使得傳感片再生，然后在注入“配體”，進行新的一輪分析。</p><p>　　SPR 傳感器在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用：如今，SPR 技術(shù)已被廣泛地用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、 核酸-蛋白質(zhì)、核酸-核酸以及藥物-蛋白質(zhì)之間相互作用的反應(yīng)動力學(xué)、親和力，還有其他一 些檢測生物分子相互作用的技術(shù)，比如酶聯(lián)免疫標(biāo)記（ELISA）、平衡透析（equilibrium dia

17、lysis）、親和層析（affinity chromatography）等，與這些技術(shù)相比較，SPR 主要有兩大優(yōu)點：1、實時監(jiān)測生物分子的相互作用。2、不需要作標(biāo)記。</p><p>　　自1983 年 SPR 被首次應(yīng)用與抗原-抗體的檢測后，SPR 應(yīng)用領(lǐng)域逐漸擴大。主要有免 疫學(xué)、蛋白質(zhì)相互作用（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、肽庫和抗體庫篩選、分析蛋白質(zhì)的突變等）、蛋白質(zhì)- 核酸相互作用（修復(fù)、轉(zhuǎn)錄等），還有藥物-蛋白質(zhì)作用（

18、藥物篩選等）。</p><p>　　在免疫學(xué)中，SPR技術(shù)可以識別抗原的種類，獲得抗原-抗體結(jié)合的動力學(xué)常數(shù)與親和 力常數(shù)。T 淋巴細(xì)胞的激活是由 T 細(xì)胞受體（TCR）與 MHC 分子和抗原遞呈細(xì)胞遞呈的抗原（Ag）組成的復(fù)合物相互作用而啟動的。Margulies[4] 等用該方法研究了 MHC 與 Ag，TCR與 MHC/Ag，TCR 與超抗原相互作用的動力學(xué)常數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) MHC-抗原與 TCR 相互作用

19、的親和力低、半衰期短，超抗原與 TCR 比它略高，說明短暫而低親和力的相互作用即可激活T淋巴細(xì)胞。</p><p>　　在蛋白質(zhì)研究中，目前采用二維電泳來分離復(fù)雜的蛋白質(zhì)并采用質(zhì)譜法鑒定蛋白質(zhì)，這 些研究獲得了豐富的數(shù)據(jù)，同時也給進一步研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系提出了許多問題。 要解決這些問題需要有能研究生物分子識別及相互作用的高特異性方法，SPR 技術(shù)正逐漸成 為解決這一問題的主要手段。</p>

20、<p>　　apolipophorinⅢ是無脊椎動物血淋巴中的一種載脂蛋白，它有重要的運輸功能，而且與脊椎動物的載脂蛋白有很大相似性，因此它與脂的相互作用很受關(guān)注。Soulages 等通過 SPR 技術(shù)發(fā)現(xiàn)了這種蛋白質(zhì)與類脂反應(yīng)需要兩個步驟，即兩步反應(yīng)機理。</p><p>　　在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中，Schuster SC[6] 運用 SPR技術(shù)研究了 E.coli 中控制趨向性的信號通 路中一個復(fù)合物，

21、通過分析相互作用發(fā)現(xiàn)了一種以前沒有認(rèn)識到的蛋白激酶與底物的相互作用。</p><p>　　Bartly[7] 等進行了一項快速鑒定、篩選未知受體和配體的比較有代表性的工作，他們在 用配體垂釣方法篩選和確定了孤兒受體的未知配體時，將 ECK 受體偶連與傳感片上，然后用 不同細(xì)胞株的上清液通過傳感片表面，以測定培養(yǎng)液中有無生物分子能和 ECK 受體結(jié)合。一 旦得到陽性結(jié)果，再進一步純化該上清液，最后得到足夠的 ECK

22、 配體用于分析，確定此配體是 B61。</p><p>　　由于使用 SPR 技術(shù)可以直接從粗提液中將欲被分析的蛋白質(zhì)連接到傳感片上，因此很方 便用來分析蛋白的位點突變。在研究 CD22 分子的唾液酸識別位點的結(jié)構(gòu)中，將侯選 domains 中的某些殘基突變，使用 SPR 技術(shù)測定突變后的親和力等參數(shù)，確定連接位點的基序 。目 前對蛋白質(zhì)識別的特異結(jié)構(gòu)的認(rèn)識主要來自具有高親和力的作用，如抗體、激素受體、蛋白 酶等

23、，而對親和力較低的作用則研究很少，如細(xì)胞黏附與識別。采用 SPR 技術(shù)研究了具有弱相互作用的鼠的CD2分子的識別位點，證實了CD2的識別位點的結(jié)構(gòu)特性決定了其所具有的低親和力和高特異性[9]。</p><p>　　SPR 技術(shù)在肽庫和抗體庫的篩選上具有很大的優(yōu)越性。不僅可以給出結(jié)合與否的信息， 還可以給出動力學(xué)數(shù)據(jù)進行結(jié)合力大小的比較，結(jié)合物還可以回收進行下一步研究。Schie[10.11] 等在利用抗體庫篩選抗

24、腫瘤抗體時使用了 SPR 技術(shù)，他們測定了利用 ELISA 篩選得到的陽 性克隆與特定抗原的親和力，SPR 法比傳統(tǒng)方法節(jié)省了時間，減輕了工作量。</p><p>　　在 DNA 與蛋白質(zhì)的相互作用的研究中，特別是反應(yīng)動力學(xué)一直沒有簡捷的方法。目前采 用 SPR 技術(shù)，將含目的基因的 DNA 片段偶連與傳感片表面上，使不同濃度的蛋白流過傳感片表面，從 SPR 譜就可以計算出反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)和結(jié)合親和力。Galio[

25、12]等研究了轉(zhuǎn)錄因子 huGATA-3 和 HIV-1 長末端三個 GATA 調(diào)節(jié)元件之間的相互作用，并檢測出了它們之間相對親 和力的大小，并且首次實時分析了原始的在核提取液中的轉(zhuǎn)錄因子的連接作用。</p><p>　　SPR 技術(shù)的另一個熱點是藥物篩選。在反義核酸與基因藥物開發(fā)方面，肽核酸（PNA） 正引起越來越廣泛的關(guān)注。Jense 等測定了 PNA 與 DNA 和 RNA 的作用，結(jié)果顯示 PNA-RNA

26、 復(fù)合物的穩(wěn)定性比 PNA-DNA 高。 多肽 T22 具有和 AZT 相似的很強的抗 HIV 的活性，但其作用機制一直不知。Hirokazu Tamamura[14]等使用SPR技術(shù)證實T22通過同時連接到 T 細(xì)胞的 CD4 分子和 HIV 的 gp120 分子，抑制病毒與細(xì)胞的融合過程而起到抗病毒的作用。</p><p>　　總之，SPR技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛，它為分析生物大分子之間的特異相互作用

27、提供了一把鑰匙，使得實時、免標(biāo)記、動態(tài)分析生物分子的相互作用成為可能，為我們探索生命的奧秘又開辟了一條途徑。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　1. B Liedberg, et al. Surface Plasmon Resonance for Gas Detection and Biosensing Sensors. Actuato

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