保婦康栓微生物限度檢查法的驗證

1、<p>　　保婦康栓微生物限度檢查法的驗證</p><p>　　【摘要】 目的：消除保婦康栓的微生物限度檢查法中的抑菌作用。方法：采用薄膜過濾法進行試驗，加試驗菌回收并且計算回收率。結果：該供試品對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉的回收率均高于70 %，采用薄膜過濾法進行檢驗可滿足要求。結論：薄膜過濾法可消除藥品中抑菌物質的干擾。 </p><p>

2、　　【關鍵詞】 微生物限度檢查法；驗證試驗；薄膜過濾法；抑菌；回收率</p><p>　?。跘BSTRACT］ Objective: To eliminate the boltUNIFEM Hong microbial limits test of the antimicrobial effect. Method: To use membrane filtration method to test, test

3、 and calculation of recycling and recovery. Results: The test for products of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Bacillus subtilis, Aspergillus niger, the recovery rates were 70 percent or more, m

4、embrane filtration method can meet the requirement. Conclusion: The film filtration can eliminate drugs in antibacteri</p><p>　　［KEY WORDS］ Microbial limits test; Certification test; Membrane filtration； An

5、tibacterial; Recovery rate</p><p>　　藥品微生物限度檢查法建立時應進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證和控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法是否適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定和控制菌檢查［1］。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結果時，計數(shù)方法和檢查方法應重新驗證［2，3］。有些制劑有抑菌作用, 制備的供試液本身會影響微生物的生長，若不進行方法學驗證，所采

6、用的方法不一定適合該供試品的微生物限度檢查［4］。系統(tǒng)的方法學驗證可以避免因為選擇方法不合理而造成漏檢、誤判，以保證結果的科學可靠。</p><p><b>　　1 材料</b></p><p>　　1.1 主要儀器、藥品</p><p>　　STV3型無菌檢查薄膜濾器（浙江寧海白石藥檢儀器廠），303AS2型數(shù)顯隔水式培養(yǎng)箱（上海浦東榮

7、豐科學儀器公司），SPX25型生化培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）。保婦康栓（批號20060331,栓劑, 海南碧凱藥業(yè)有限公司）。</p><p>　　1.2 培養(yǎng)基及稀釋劑</p><p>　　玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁液體培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

8、</p><p>　　1.3 驗證試驗用菌種</p><p>　　金黃色葡萄球菌 CMCC(B) 26 003、枯草芽孢桿菌 CMCC(B) 63 501、大腸埃希菌CMCC(B) 44 102、 白色念珠菌CMCC(F) 98 001、 黑曲霉 CMCC(F)98 003、銅綠假單胞菌CMCC（B）10 101，金黃色葡萄球菌CMCC（B）26 003、銅綠假單胞菌CMCC（B）10

9、101均由海南省藥品檢驗所提供，以上菌種所用菌株均未超過5代。</p><p><b>　　2 方法與結果</b></p><p><b>　　2.1 菌液制備</b></p><p>　　（1）取經(jīng)35～37 ℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的肉湯培養(yǎng)物1 mL加9 mL滅菌生理鹽水

10、，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，控制細菌數(shù)約為50～100 cfu/ mL。（2）取經(jīng)23～28 ℃培養(yǎng)18～24 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1 mL加9 mL滅菌生理鹽水，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，菌數(shù)約為50～100 cfu/ mL。（3） 取經(jīng)23～28 ℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉菌斜面培養(yǎng)物，加3～5 mL滅菌生理鹽水洗下霉菌孢子，采用管口帶有薄無菌棉花的毛細吸管吸出菌液，取1 mL 加9

11、 mL滅菌生理鹽水，逐管10倍稀釋為10-4，菌數(shù)約為50～100 cfu/ mL。</p><p>　　2.2 供試液的制備</p><p>　　稱取本品10 g，溶于100 mL無菌pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液中，作為1∶10的供試藥液。</p><p>　　2.3 細菌、霉菌、酵母菌計數(shù)方法的驗證</p><p>　　2.3.

12、1 試驗方法 取1∶10供試液10 mL，過濾，用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗2次，每張濾膜每次沖洗量為100 mL，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于相應的培養(yǎng)基平板上，每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜，置規(guī)定溫度中培養(yǎng)24～72 h。</p><p>　　2.3.2 沖洗量的驗證 取1∶10供試液10 mL，過濾，分別用100、200、300 mL的pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗，最后一

13、次沖洗液中加入1 mL金黃色葡萄球菌的菌懸液，過濾后取出濾膜，菌面朝上貼于相應培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～72 h，結果見表1。表1 沖洗量的驗證</p><p>　　2.3.3 回收率測定 （1）試驗組：取1∶10供試藥液10 mL，照上述方法操作,最后一次沖洗液中加入1 mL菌液,過濾后取出濾膜,分別菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿中30～35℃培養(yǎng)48 h觀察結果，逐日點計菌落數(shù)，以48 h的菌落數(shù)報告。

14、（2）菌液組：測定每一菌株的試驗菌液1 mL,依照試驗組方法進行試驗。（3）供試藥品對照組：不加菌液，其它操作同試驗組，測定樣品本底菌數(shù)。（4）稀釋劑對照組：取無菌pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液,按照試驗組的沖洗量過濾,在最后一次沖洗中逐一加入試驗菌液1 mL, 過濾后取出濾膜, 其它操作同試驗組。（5）回收率計算公式：試驗組的菌回收率(%)=（試驗組菌落數(shù)均值-試品對照組菌落數(shù)均值）/菌液組菌落數(shù)均值×100%，稀釋劑

15、對照組回收率(%)=稀釋劑對照組菌落數(shù)均值/菌液組菌落數(shù)均值×100%。</p><p>　　海南醫(yī)學院學報 Vol.15 No.1 Feb.2009從表2結果可知,采用薄膜過濾法檢驗保婦康栓供試品，人工污染5株代表菌株，該供試品對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉的回收率均高于70%，故可采用薄膜過濾法進行檢驗。表2 薄膜過濾法各試驗菌回收率（%）(沖洗量：200 mL)

16、</p><p>　　組別實驗次數(shù)大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗組181918279752768280867438274928981稀釋劑對照組183798980712798677798238875839077</p><p>　　2.4 控制菌檢查方法的驗證 </p><p>　　2.4.1 試驗方法及菌液、供試液的制備 （1）試驗

17、方法采用薄膜過濾法［5］。（2）菌液制備：取經(jīng)37 ℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 mL加9 mL無菌生理鹽水，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6，細菌數(shù)約為10～100 cfu/ mL。（3）供試液的制備：同“2.2項”下供試液的制備。</p><p>　　2.4.2 驗證方法 （1）試驗組：① 分別取幾份供試液10 mL過濾，沖洗，取出一份濾膜接入

18、100 mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中；其中一份在最后一次沖洗液中加入1 mL菌數(shù)約為10～100 cfu/ mL 的銅綠假單胞菌，過濾后，取出濾膜接入100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中作為陽性對照；另取與供試液等量的稀釋劑按薄膜過濾法操作后，取出接入100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中作為陰性對照，35～37℃ 培養(yǎng)18～24 h，取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)18～24 h，結果見表3。② 分別取幾份供試液10

19、 mL過濾，沖洗，取出一份濾膜接入100 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中；其中一份在最后一次沖洗液中加入1 mL菌數(shù)約為10～100 cfu/ mL 的金黃色葡萄球菌，過濾后，取出濾膜接入100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中作為陽性對照；另取與供試液等量的稀釋劑按薄膜過濾法操作后，取出接入100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中作為陰性對照，35～37 ℃培養(yǎng)18～24 h，取上述培養(yǎng)物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)18～24 h，結果見表

20、3。（2）陰性對照組</p><p>　　從表3結果可知，試驗組銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌生長良好，本品對其沒有抑菌作用；陰性菌未檢出，表明該檢查方法的專屬性良好，可用于保婦康栓的控制菌檢查。表3 控制菌檢查結果（沖洗量200 mL） 注:“＋”代表反應陽性，“－”代表反應陰性。</p><p><b>　　3 結論</b></p><p&

21、gt;　　藥品要做微生物限度檢查前,應該確認所選用的方法,需根據(jù)藥品的性質選用適宜的一種方法或幾種方法進行驗證,確認所選用的方法是否可行,所得結果是否真實、可靠。</p><p>　　本試驗結果可知，保婦康栓的微生物限度檢查可采用薄膜過濾法［5］進行,即取本品10 g溶于100 mL 的無菌pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液中，取1 mL薄膜過濾,以0.1 %蛋白胨水沖洗, 沖洗量為200 mL。</p

22、><p>　　保婦康栓本身具有抑菌作用, 制備的供試藥液會影響微生物的生長，經(jīng)微生物限度檢查法的驗證試驗證明，選用薄膜過濾法可消除藥品中抑菌物質的干擾，得到準確的測定結果。</p><p><b>　　【參考文獻】</b></p><p>　　1 張道坤，張路兵，曾元臨，等.經(jīng)輻照氯銀處理臍靜脈的抑菌效果觀察［J］.實用臨床醫(yī)藥雜志，2006，10

23、（4）：12，6.</p><p>　　2 馬緒榮,蘇德模. 藥品微生物學檢驗手冊［M］.北京:科學出版社,2001.40.</p><p>　　3 劉澤春.基層衛(wèi)生微生物檢查質量控制［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2000，10（5）:622.</p><p>　　4 裘雪友.藥師手冊［M］.第2版.北京：人民軍醫(yī)出版社，2003.41.</p><