萱草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選[畢業(yè)設(shè)計(jì)]

1、<p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)</p><p><b>　　（二零 屆）</b></p><p>　　萱草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 生物工程 </

2、p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　摘 要</b></p><p&

3、gt;　　在本實(shí)驗(yàn)中以萱草花梗莖段為試驗(yàn)試材,以MS為基本培養(yǎng)基,分別添加不同濃度的BA和NAA來(lái)確定最佳的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基，試驗(yàn)結(jié)果表明:MS + BA 0.5mg/L + NAA 0.1mg/L的固體培養(yǎng)基,有很好的誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織的效果。</p><p>　　關(guān)鍵詞：萱草；組織培養(yǎng)；MS培養(yǎng)基 </p><p>　　Callus induction Hemerocallis

4、Screening</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　The experiments were used the stem of Hemerocallis fulva as test plant. The MS as culture medium were each added different concentration B

5、A and NAA. The results of experiments: MS solid culture medium added BA 0.5mg/L and NAA 0.1mg/L had good induced effect to explantation growth callus.</p><p>　　Keyword: Hemerocallis ；tissue culture；MS medium

6、</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　1 緒論5</b></p><p><b>　　1.1 概述5</b></p><p>　　1.2 萱草的傳統(tǒng)繁殖方法5</p><p>　　1.3 萱草的現(xiàn)代繁殖方法6&l

7、t;/p><p><b>　　2 材料與方法8</b></p><p>　　2.1.1 試驗(yàn)材料8</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品9</p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器9</p><p>　　2.2.1 培養(yǎng)基的制備9</p><p>　　2.2.2

8、萱草外植體處理10</p><p>　　2.2.3 接種及培養(yǎng)11</p><p>　　2.2.4 培養(yǎng)條件12</p><p>　　2.2.5 初代培養(yǎng)12</p><p>　　3 結(jié)果與分析13</p><p>　　3.1 不同滅菌劑及滅菌時(shí)間對(duì)外植體污染率與成活率的影響13</p>&l

9、t;p>　　3.2 不同激素組合對(duì)初代培養(yǎng)的影響13</p><p><b>　　4 討論15</b></p><p>　　4.1 萱草植物組織培養(yǎng)中的滅菌操作15</p><p>　　4.2 萱草植物組織培養(yǎng)中對(duì)植物激素的選擇15</p><p>　　4.3 萱草植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件的選擇

10、16</p><p>　　致 謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)17</b></p><p><b>　　1 緒論</b></p><p><b>　　1.1 概述</b></p><p>　　萱草在我國(guó)有悠久的栽培歷史，從最

11、早的文字記載于《詩(shī)經(jīng)》來(lái)看，萱草在我國(guó)已有三千年以上的栽培史。歷代文人也常以之為詠吟的題材。曹植為之作頌，夏侯湛為之作賦，唐宋明清李白、溫庭筠、韋應(yīng)物、蘇東坡、黃山谷、孟郊、高啟、姚永概等詩(shī)人都寫有萱草詩(shī)。萱草的栽培在漢代以后就很普遍了，不論是在黎庶人家，還是在貴族豪門，都有她的蹤跡。南朝梁簡(jiǎn)文帝見到妓院中種植的萱草花，不免感慨成詩(shī)：“可愛宜男草，垂采映倡家；何時(shí)如此葉，結(jié)根復(fù)含花。”唐玄宗時(shí)，興慶宮中栽種了多種萱草，有人作詩(shī)譏諷說：“

12、清萱到處碧霧荔，興慶宮前色倍含；借問皇家何種此?太平天子要宜男。”可見萱草栽培之普遍。萱草主產(chǎn)秦嶺以南各省區(qū)以及河北、山西和山東。生長(zhǎng)于海拔2000米以下的山坡、山谷、荒地或林緣?，F(xiàn)在，陜西、甘肅、江蘇、安徽、河南等省的許多地區(qū)都有大面積種植。</p><p>　　萱草，別名金針菜、黃花菜。多年生宿根花卉，地下具短粗的根狀莖，根系肉質(zhì)。葉叢狀基生，呈條帶狀披針形?；ㄆ?～8月，花莖高l米左右，頂生聚傘花序，每序著

13、花6~12朵，花大，漏斗狀，桔紅色，蒴果[1]。萱草的園藝品種多達(dá)萬(wàn)種以上。根據(jù)其顏色不同，大致上分為白色系、黃色系、桃紅色系、紅色系、暗紅色系和紫色系等。萱草有重瓣變種，長(zhǎng)筒萱草、玫瑰紅萱草、大花萱草等多數(shù)變種，并有四倍體品種。</p><p>　　1.2 萱草的傳統(tǒng)繁殖方法</p><p>　　萱草的傳統(tǒng)繁殖方法有分株繁殖、播種繁殖、分芽花芽繁殖、扦插繁殖等，以下就一一敘述：</

14、p><p>　　1.2.1 分株繁殖</p><p>　　萱草莖極短，株形成根出葉狀。秋季在當(dāng)年花莖以下的根莖部位，萌發(fā)出2～3個(gè)新芽，于翌年春發(fā)葉，并長(zhǎng)出新根，成為新的植株。另外萱草短莖基部的芽，能發(fā)育成5～10cm的匍匐枝，枝的頂芽萌芽出土，形成新株。根據(jù)萱草萌蘗的發(fā)生，萱革分株繁殖多數(shù)情況可在春秋兩季進(jìn)行，春季分株宜在2月底3月初芽萌動(dòng)前，秋季分株可在10月新芽形成后，植株休眠越冬前。園

15、林栽植分株用40cm×40cm的株行距，每叢保留2～3支苗[2]。</p><p>　　1.2.2 播種繁殖</p><p>　　萱草自然生長(zhǎng)很少能夠結(jié)實(shí)，SF-2、SF-6通過人工輔助授粉，能獲得種子，同時(shí)也可利用人工雜交選育新種。在蘇州地區(qū)，雜種萱種花期主要集中在6月中下旬，部分品種有2次開花現(xiàn)象。萱草單花壽命一般不超過24 h，一般上午9：00～11：00是授粉最佳期，可收

16、集花粉授于柱頭。經(jīng)30～40 d，在7～8月期間果實(shí)成熟。成熟種子胚占很大部位，如胚乳失水，胚極易因干燥而死亡，因此果實(shí)宜在果皮轉(zhuǎn)黃、種皮已黑時(shí)采收，采收后應(yīng)立即播種，或用濕藏法進(jìn)行砂藏或低溫保鮮貯藏，使種子保留到8月上旬播種，第2年分植，第3年見花。</p><p>　　1.2.3 分芽花芽繁殖</p><p>　　分芽花芽指大花萱草花莖上小的植株。花芽可以從花莖上切割下來(lái)，若體積較大，

17、在種植前可以進(jìn)一步分割。移植后的花芽在一周后即可生根?？梢岳蒙幕ㄑ糠敝持仓辏岣咴灾驳臄?shù)量，最終提高經(jīng)濟(jì)效益。</p><p>　　1.2.4 扦插繁殖</p><p>　　萱草有些品種在花莖抽出后，自花莖中下部的節(jié)位上發(fā)生莖生芽，莖生芽可在花莖干枯前剝下扦插成苗。</p><p>　　總之，不管不管采用何種傳統(tǒng)繁殖方法，萱草的繁殖率都比較偏低，難以適應(yīng)市場(chǎng)商

18、品化生產(chǎn)的需求。所以，尋求一種新的穩(wěn)定而高效的繁殖方法，對(duì)萱草具有重要意義。</p><p>　　1.3 萱草的現(xiàn)代繁殖方法</p><p>　　1.3.1 植物組織培養(yǎng)</p><p>　　植物組織培養(yǎng)[3]是指將植物體的任何器官、組織或細(xì)胞，在人工預(yù)知的控制條件下，放在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和植物生長(zhǎng)物質(zhì)等組成的培養(yǎng)基中，使其得以繼續(xù)生長(zhǎng)、分化形成完整植株的過程。作為上世

19、紀(jì)發(fā)展起來(lái)的一門新技術(shù)，已一躍成為一種大規(guī)模、批量工廠化生產(chǎn)種苗的新方法，并在花卉和蔬菜生產(chǎn)上得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。采用組織培養(yǎng)法繁殖萱草，可大幅提高種苗的質(zhì)量和產(chǎn)量，減少勞動(dòng)力，是解決優(yōu)良品種大量繁殖的最有效途徑。不僅可以克服常規(guī)繁殖方法的不足，提高繁殖系數(shù)，加快其繁殖速度，還可打破季節(jié)局限，實(shí)現(xiàn)工廠化育苗，滿足市場(chǎng)的需求。</p><p>　　1.3.2 萱草組織培養(yǎng)方法</p><p&g

20、t;　　利用萱草莖尖或種子的胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，繁殖種苗。通常初代培養(yǎng)基配方為Ms+BA 2 mg／L+NAA 0．1 mg／L+2．4一D 0．5 mg／L，培養(yǎng)溫度22～24℃，光照強(qiáng)度為1 500 lx，光照12 h／d，2～3月后形成愈傷組織。繼代培養(yǎng)用MS+BA 2 mg／L+NAA 0．1 mg／L培養(yǎng)基。每4周增殖1次，獲得大量無(wú)根苗后在MS+NAA0．1 mg／L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)發(fā)根，經(jīng)2～3周可誘導(dǎo)出粗壯幼根。試管苗育成后，

21、移栽于經(jīng)過消毒的苗床上，保持溫度(20±2)℃，相對(duì)濕度80％以上，注意通風(fēng)遮陰，移栽成活率可達(dá)95％以上。</p><p>　　1.3.3萱草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的研究</p><p>　　萱草離體培養(yǎng)在國(guó)外研究較早,Meyer (1976) [4]、Griesbach(1989) [5]、Saker (1998)[6] 等先后對(duì)萱草離體培養(yǎng)的研究。我國(guó)對(duì)萱草組織培養(yǎng)研究較晚，如

22、今，萱草屬植物的快繁技術(shù)也已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，且主要集中在食用黃花菜和多倍體萱草。</p><p>　　孔剛通過采取大花萱草5個(gè)品種的花莖、花瓣做為外植體，接種在相同的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)。結(jié)果表明不同品種大花萱草存在很大的差異，而同一品種的不同部位其愈傷組織的誘導(dǎo)率也不相同，花莖優(yōu)于花瓣。說明大花萱草的組織培養(yǎng)應(yīng)因品種而異，針對(duì)不同的品種選取不同的培養(yǎng)基及適當(dāng)?shù)募に貪舛萚7]。</p&g

23、t;<p>　　劉先芳以重瓣大花萱草帶生長(zhǎng)點(diǎn)的莖段為試材，以MS與1／2MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的2，4一D，6一BA，NAA。試驗(yàn)結(jié)果表明：MS+6一 Balmg/l+ NAA0．1mg／l的固體培養(yǎng)基，有很好的誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生不定芽苗的效果；而MS+2，4一D2ms／l+6一BA0．1mg／l的培養(yǎng)基能很快誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織；愈傷組織在MS+6一BAlmg／l的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，形成結(jié)構(gòu)致密的球狀體愈傷組織，

24、并分化出苗，經(jīng)繼代培養(yǎng)后，形成叢狀苗[8]。</p><p>　　解有利以大花董草外植體為研究對(duì)象，探討了不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)大花萱草外植體分化、生根的影響．對(duì)移栽技術(shù)進(jìn)行了研究。組織培養(yǎng)最適宜的大花董草外植體材科為花瓣和花莖，而地下塊莖、葉片也可誘導(dǎo)腋芽的發(fā)生，0.l％升汞的消毒效果最好；適宣的初帶培養(yǎng)基為Ms+0.3mg/lNAA+30g/l蔗糖【9】。</p><p>　　陳春玲以比利

25、時(shí)引進(jìn)的優(yōu)良品種萱草的花作為外植體，進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，成功地建立了萱草組培快繁技術(shù)體系。結(jié)果表明,不同濃度激素對(duì)其誘導(dǎo)、增殖及根的形成有不同影響。最適培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 Ms+2.0mg/LBA+0.01mg/LIAA</p><p>　　+1mg/L2-4D【10】</p><p>　　劉志洋取大花萱草莖尖為外植體接種在不同培養(yǎng)基上，研究了不同濃度的NAA和6-BA對(duì)于外植體生長(zhǎng)的影響，

26、并探索最適于產(chǎn)生愈傷組織和生根的培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明，有利于外植體產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)基配方是 MS+6-BA1.0mg.L-1+ NAAO.05 mg.L-1+30 g糖+8 g瓊脂；適合愈傷組織誘導(dǎo)生芽培養(yǎng)基配方是MS+6一BA1.0 mg.L-1+30 g糖+8 g瓊脂：適合幼苗生根的培養(yǎng)基配方是1/2MS+NAA 0．5 mg.l-1+30 g糖十8 g瓊脂[11]。</p><p>　　雖然對(duì)萱草組培

27、技術(shù)的已有不少相關(guān)報(bào)道，但是作為一種市場(chǎng)價(jià)值較高的新型花卉，其快繁體系的研究尚不完備。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)嘉興本地氣候因素，利用生物系實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，初步探討萱草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選，以期為今后的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 材料</b></p><

28、p>　　2.1.1 試驗(yàn)材料</p><p>　　試驗(yàn)材料為吉星萱草植株(圖2-1)。</p><p>　　圖2-1 試驗(yàn)用萱草植株</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品</p><p>　　HgCl2、瓊脂、蒸餾水、乙醇、氫氧化鉀、鹽酸、蔗糖、NH4NO3、KNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2

29、3;2H2O、KI、H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2·MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、Na2·EDTA·2H2O、肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、甘氨酸</p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器</p><p>　

30、　玻璃棒、pH計(jì)、1000ml燒杯、電磁爐、不銹鋼鍋、玻璃容器、鑷子、刀片、超凈工作臺(tái)、濾紙、培養(yǎng)皿等</p><p><b>　　2.2 方法</b></p><p>　　2.2.1 培養(yǎng)基的制備</p><p>　　2.2.1.1 MS基本培養(yǎng)基的配方</p><p>　　母液Ⅰ：NH4NO3(33g/L)、KNO

31、3(38g/L)、MgSO4·7H2O(7.4g/L)、KH2PO4(3.4g/L)</p><p>　　母液Ⅰ(Ca2+)：CaCl2·2H2O(8.8g/L)</p><p>　　母液Ⅱ：KI（0.166g/L）、H3BO3（1.24g/L）、MnSO4·4H2O（4.46g/L）、ZnSO4·7H2O（1.72g/L）、Na2·MoO

32、4·2H2O（0.05g/L）、CuSO4·5H2O（0.005g/L）、 CoCl2·6H2O（0.005g/L）</p><p>　　母液Ⅲ：FeSO4·7H2O(5.56g/L)、Na2·EDTA·2H2O(7.46g/L)</p><p>　　母液Ⅳ：肌醇(20g/L)、煙酸(0.1g/L)、鹽酸吡哆醇(0.1g/L)、

33、鹽酸硫胺素(0.1g/L)、甘氨酸(0.4g/L)</p><p>　　2.2.1.2 制備培養(yǎng)基的步驟</p><p>　　⑴ 在1000ml的大燒杯中加入蒸餾水約600ml，用移液槍分別加入母液Ⅰ100ml，母液Ⅰ（Ca2+）50ml，母液Ⅱ10ml，母液Ⅲ10ml，肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、甘氨酸各2ml；</p><p>　　⑵ 再在燒杯中加入適

34、宜濃度所選擇的植物激素BA和NAA；</p><p>　?、?加入適量蒸餾水使定容到1000ml,將燒杯置于pH計(jì)上，放入磁珠，打開開關(guān)，使溶液攪拌均勻；</p><p>　　⑷ 充分混合之后，用1mol/L NaOH和1mol/L HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值到5.8；</p><p>　?、?將混合溶液倒入不銹鋼鍋中，并加入稱出的4.5g瓊脂和30g蔗糖，加熱，同時(shí)

35、用玻璃棒不斷攪拌，直至溶液沸騰到顏色澄清；</p><p>　?、?趁熱把溶液倒回大燒杯中，加入蒸餾水再次定容到1000ml（彌補(bǔ)沸騰蒸發(fā)所失去的水分），緊接著將培養(yǎng)基分裝到所選用的玻璃容器中，每個(gè)大概75ml；</p><p>　　⑺ 擰好特質(zhì)的塑料蓋后，置于高壓滅菌鍋0.11MPa 121℃滅菌20分鐘；</p><p>　?、?滅好菌后，將玻璃容器放置于接種用

36、的無(wú)菌室中，使之冷卻，凝固，備用。</p><p>　　2.2.2 萱草外植體處理</p><p>　　萱草外植體選用幼嫩花梗，在接種前需將外植體進(jìn)行滅菌處理，處理步驟如下：</p><p>　?、?從健壯、無(wú)病蟲害的吉星萱草植株上選取幼嫩花梗，將之浸泡在裝有洗衣粉溶液的大燒杯中30min；</p><p>　?、?之后置于自來(lái)水龍頭下，流水

37、沖洗3至4小時(shí)，為防止花梗由于浮力而劃出燒杯，可以用紗布覆蓋燒杯口；</p><p>　?、?在噴灑過70%乙醇和紫外燈消毒30min后的無(wú)菌室內(nèi)，開啟超凈工作臺(tái)，用浸泡在70%乙醇中的酒精棉擦洗臺(tái)面；</p><p>　?、?材料沖洗完后，戴上一次性手套，在超凈工作臺(tái)上分別對(duì)外植體進(jìn)行以下五組方法滅菌處理：</p><p>　　第一組：用70％酒精浸泡、振蕩15s

38、傾出；</p><p>　　第二組：用0.2％HgCl2浸泡、振蕩8min；</p><p>　　第三組：用0.2％HgCl2浸泡、振蕩12min；</p><p>　　第四組：用70％酒精浸泡、振蕩15s傾出，然后再用0.2％HgCl2浸泡、振蕩8min；</p><p>　　第五組：用70％酒精浸泡、振蕩15s傾出，然后再用0.2％HgC

39、l2浸泡、振蕩12min，</p><p>　　這樣做是用于統(tǒng)計(jì)不同滅菌劑以及滅菌時(shí)間對(duì)外植體的影響；</p><p>　?、?在花梗進(jìn)行滅菌時(shí)，準(zhǔn)備好接種所需要的工具，包括培養(yǎng)皿、鑷子、酒精燈、濾紙、架子、刀片等，這些工具都事先經(jīng)過高壓滅菌鍋滅菌消毒，但是在擺放在超凈工作臺(tái)之前，還要先經(jīng)過酒精噴灑并置于酒精燈上灼燒3次，進(jìn)一步滅菌；</p><p>　?、?萱草材

40、料二次滅菌完畢后，用滅菌過的無(wú)菌水沖洗花梗6次；</p><p>　?、?用消過毒并已經(jīng)冷卻的鑷子取出萱草花梗，置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，使之水分被吸收；</p><p>　　⑻ 用消毒后并冷卻了的刀片，在酒精燈旁切掉花梗被滅菌劑毒害的部分（呈黑色），將花梗切成2cm長(zhǎng)左右的莖段（圖2-2）。</p><p>　　圖2-2 萱草花梗莖段</p><

41、p>　　2.2.3 接種及培養(yǎng)</p><p>　　萱草外植體經(jīng)過處理后，就要進(jìn)行接種，接種步驟如下：</p><p>　?、?取裝有培養(yǎng)基的玻璃容器，在酒精燈上方小心打開蓋子（打開時(shí)瓶口不可正對(duì)超凈工作臺(tái)風(fēng)口），并將瓶口和蓋子在火焰上方晃動(dòng)消毒；</p><p>　?、?放下瓶蓋，用鑷子將莖段小心放置于培養(yǎng)基表面，操作過程始終在酒精燈旁，但不在培養(yǎng)皿上方；&

42、lt;/p><p>　?、?接種好后，再次用火焰消毒瓶口和蓋子內(nèi)側(cè)，并在火焰旁蓋好蓋子；</p><p>　?、?接種好后，盡量是接近平移的狀態(tài)將玻璃容器移置到培養(yǎng)室，進(jìn)行培養(yǎng)；</p><p>　?、?在初代培養(yǎng)成功后，要在同樣嚴(yán)格的條件下，將叢生芽切下，并移植到繼代培養(yǎng)基上，進(jìn)行快速繁殖；</p><p>　?、?生根培養(yǎng)是在叢生芽生長(zhǎng)到一定

43、高度后，再把它在同樣嚴(yán)格的操作條件下移植到生根培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)基是一成熟培養(yǎng)基，故不用探討。</p><p>　　2.2.4 培養(yǎng)條件</p><p>　　在植物組織培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件是：光照強(qiáng)度約為2000Lx，光照時(shí)間14h/d。采用恒溫培養(yǎng)，溫度為25±3℃ (圖2-3)。</p><p>　　圖2-3 萱草植物組織培養(yǎng)室</p&

44、gt;<p>　　2.2.5 初代培養(yǎng)</p><p>　　將無(wú)污染宣草花梗莖段接種到誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方分別是：</p><p>　　① MS + BA(0.5mg/L) + NAA(0.05mg/L)；</p><p>　　② MS + BA(0.5mg/L) + NAA(0.1mg/L)；</p><p&g

45、t;　?、?MS + BA(1.0mg/L) + NAA(0.05mg/L)；</p><p>　　④ MS + BA(1.0mg/L) + NAA(0.1mg/L),</p><p>　　在上述培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)狀況，從中選擇出最優(yōu)組合。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　

46、　3.1 不同滅菌劑及滅菌時(shí)間對(duì)外植體污染率與成活率的影響</p><p>　　滅菌時(shí)間是從倒入滅菌液開始，至倒入無(wú)菌水時(shí)為止。滅菌主要是殺滅外植體表面的微生物及其產(chǎn)生的孢子，但不能殺死寄生在植物內(nèi)部的病毒等。</p><p>　　表3-1不同滅菌劑及滅菌時(shí)間對(duì)外植體污染率及成活率的影響</p><p>　　從表3-1中進(jìn)行概率計(jì)算可知，單用70%乙醇做為滅菌劑處

47、理外植體15s時(shí)，污染率高達(dá)88.0%；單用HgCl2做為滅菌劑處理外植體時(shí)，污染率分別為42.0%(8min)、48%(12min)；先用70%乙醇處理外植體15s，再用HgCl2處理外植體，污染率分別是16.0%(8min)、14.0%（12min）。但是，就成活率而言，70%乙醇溶液處理15s后，再用HgCl2處理8min的外植體成活率達(dá)90.5%；單用HgCl2處理外植體的，成活率緊隨其后，分別為86.2%(8min)、84.6

48、%(12min)；而只用70%乙醇處理的外植體成活率最低，只有66.7%。因此，從污染率要低和成活率要高兩方面來(lái)考慮，用70%乙醇處理外植體15s后再用HgCl2處理8min是進(jìn)行萱草莖段滅菌的最佳滅菌劑組合和滅菌時(shí)間。</p><p>　　3.2 不同激素組合對(duì)初代培養(yǎng)的影響</p><p>　　初代培養(yǎng)是指將萱草莖段接種到初代培養(yǎng)基上，使其生長(zhǎng)出愈傷組織的過程。萱草莖段的初代培養(yǎng)用MS

49、基本培養(yǎng)基。初代培養(yǎng)基中只添加BA和NAA兩種激素。在該培養(yǎng)基上進(jìn)行一定時(shí)期的培養(yǎng)后，愈傷組織生長(zhǎng)情況如表3-2所示。</p><p>　　表3-2不同激素組合對(duì)萱草愈傷組織誘導(dǎo)的影響</p><p>　　圖3-1 顏色綠的愈傷組織</p><p>　　圖3-2 顏色淺綠的愈傷組織</p><p>　　圖3-3 顏色發(fā)白的愈傷組織</p

50、><p>　　由上表可知，較低濃度的BA(0.5mg/L)和NAA(0.05mg/L)的組合誘導(dǎo)愈傷組織顏色發(fā)白、質(zhì)地松散；BA(0.5mg/L)和NAA(0.lmg/L)的組合誘導(dǎo)的愈傷組織顏色綠、質(zhì)地松散；BA(1.0mg/L)和NAA(0.05mg/L)的組合誘導(dǎo)的愈傷組織顏色淺綠、質(zhì)地硬；BA(1.0mg/L)和NAA(0.1mg/L)的組合誘導(dǎo)的愈傷組織顏色綠、質(zhì)地硬?？紤]到愈傷組織應(yīng)顏色綠、質(zhì)地松散才比較

51、容易長(zhǎng)出叢生芽，而且叢生芽質(zhì)量較好。因此，MS + BA(0.5mg/L) + NAA(0.1mg/L)的配方為最優(yōu)。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　4.1 萱草植物組織培養(yǎng)中的滅菌操作</p><p>　　文獻(xiàn)中[7、13、14、15]大多是只用0.1%HgCl2單一滅菌劑進(jìn)行外植體的滅菌5-15min，或

52、者只用75%或70%酒精振蕩30s。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)合使用70％酒精和0.2％HgCl2結(jié)合使用，不僅能消滅節(jié)實(shí)驗(yàn)材料的細(xì)菌，還能保證除滅萱草外植體表面的常規(guī)微生物的生物活性。酒精具有較強(qiáng)的穿透力和殺菌力，可使細(xì)菌蛋白質(zhì)變性，而且易揮發(fā)，所以處理時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)引起植物細(xì)胞收縮脫水。酒精唯一的缺點(diǎn)是只適用于表面滅菌，不能達(dá)到徹底滅菌的效果。HgCl2是一種劇毒的重金屬鹽殺菌劑，Hg2+可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使細(xì)菌蛋白變性，酶失活。但是

53、，其對(duì)外植體的殺傷作用也非常大，而且較難徹底的清除，所以需要用無(wú)菌水多次洗滌，來(lái)避免殘留HgCl2對(duì)外植體的組織培養(yǎng)帶來(lái)影響，相比酒精而言，酒精這方面占優(yōu)勢(shì)。由于HgCl2有劇毒，對(duì)于HgCl2的操作要小心，HgCl2的廢液也要按相應(yīng)的規(guī)格處理。</p><p>　　4.2 萱草植物組織培養(yǎng)中對(duì)植物激素的選擇</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)中植物激素是選擇了不同濃度的BA為細(xì)胞分裂素和NAA為

54、生長(zhǎng)素。在組織培養(yǎng)中，加入細(xì)胞分裂素的目的，主要是為促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷組織或器官上分化叢生芽，而生長(zhǎng)素被用于誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化。實(shí)驗(yàn)采用了人工合成的BA和NAA，因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)的所有藥品和工具的操作都需要在高溫高壓滅菌的條件，天然的生長(zhǎng)素?zé)o法滿足如此條件，所有采用人工合成的BA和NAA來(lái)保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。</p><p>　　4.3 萱草植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件的選擇</p><

55、;p>　　在本實(shí)驗(yàn)中，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加以不同濃度的BA和NAA進(jìn)行培養(yǎng)，最終確定初代培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基所添加到BA濃度是0.5mg/L，NAA濃度是0.1mg/L。通過參考文獻(xiàn)的查閱【8、14、15】，培養(yǎng)溫度(25±2)℃,每天光照12 h,光照度1200-2200 lx條件。我們?cè)O(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)條件為：在光照強(qiáng)度約為2000Lx，光照時(shí)間14h/d，采用恒溫培養(yǎng)，溫度為25±3℃。</p>

56、<p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] . Shiu—ying Hu．An Early History of Daylily[J]．The American Hordcul—</p><p>　　tural Magazine，1968。Spring：51-86．</p><p>　　[2] 王學(xué)勇，徐振華，儲(chǔ)

57、博彥．大花萱草栽培管理技術(shù)[J]．河北林業(yè)科技，</p><p>　　2002（1）：21-22</p><p>　　[3] Wikipedia. Plant tissue culture.the free encyclopedia</p><p>　　[4] M.M.Meyer,Jr.Propagation of Daylilies by Tissue Cltu

58、re[J].HortScience, 1976,11(5):485-487</p><p>　　[5] Griesbach,R.J..Selection of a dwarf hemerocallis through tissue culture[J]. HortScience,1989,24(6):1027-1028</p><p>　　[6] Saker,M..Towards comm

59、ercial procduction of ornamental bulbs in vitro[J]. Egyptian Journal of Horticulture,1998,25(1):113-128</p><p>　　[7] 孔剛.大花萱草的組織培養(yǎng)[J].國(guó)土與自然資源研究,2001,(3):79-80</p><p>　　[8] 劉先芳.重瓣大花萱草組織培養(yǎng)快速繁殖的研究[J

60、].湖南林業(yè)科技, 2001,28(3):41-42,34</p><p>　　[9] 解有利.陳蘭芬.石進(jìn)朝.大花萱草組織培養(yǎng)研究 [J].北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)2007,21(5) </p><p>　　[10] 陳春玲. 趙世偉.萱草的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J], 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)J 2007,15</p><p>　　[11] 劉志洋．大．花瓷草盼組織培養(yǎng)研究[

61、J]．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)。2008</p><p>　　(1)：43—45．：‘</p><p>　　[12] 劉志洋.大花萱草組織培養(yǎng)研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(1): 43-44</p><p>　　[13] 宋陽(yáng).萱草花莖離體培養(yǎng)研究[J].北方園藝,2007,(1):155-156</p><p>　　[14] 胡美峰