畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）studies on degradation of crab shell into chitooligosaccharide by chemical and enzymatic method

1、<p>　　泉 州 師 范 學(xué) 院</p><p><b>　　畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）</b></p><p>　　題 目 　化學(xué)法、酶法聯(lián)合降解蟹殼制備殼寡糖的研究</p><p>　　化學(xué)與生命科學(xué) 學(xué)院 應(yīng)用化學(xué) 專業(yè) 2010 級(jí) 藥學(xué) 班</p><p>　　學(xué)生姓名

2、 學(xué) 號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職 稱 副教授 </p><p>　　完成日期 2014年4月24日 </p><p><b>　　教務(wù)處 制</b><

3、/p><p>　　化學(xué)法、酶法聯(lián)合降解蟹殼制備殼寡糖的研究</p><p>　　摘要：本文采用醋酸脫鈣胰蛋白酶脫蛋白提取甲殼素并用溶菌酶降解制備殼寡糖，以降解產(chǎn)物殼寡糖含量為指標(biāo)，單因素法考察pH、酶濃度、溫度、時(shí)間對(duì)溶菌酶降解甲殼素的影響，確定溶菌酶降解甲殼素的大致條件；進(jìn)一步采用正交試驗(yàn)法確定溶菌酶降解甲殼素殼的最佳工藝條件。應(yīng)用TLC方法檢測(cè)降解產(chǎn)物。結(jié)果表明：溶菌酶降解甲殼素的最佳工藝

4、條件是溫度55 ℃，pH 5.2，酶濃度0.50 mg/mL，時(shí)間為5 h，酶解產(chǎn)物主要是幾丁二糖。</p><p>　　關(guān)鍵詞：溶菌酶；蟹殼；降解；幾丁寡糖 </p><p>　　Studies on Degradation of Crab Shell into Chitooligosaccharide by Chemical and Enzymatic Method </p>

5、;<p>　　Abstract: In this paper，the extraction of chitin by chemical method and degradation by enzymatic means．The effects of pH，enzyme concentration，temperature and time on the degradation of crab shell with lysoz

6、yme，are investigated by the methods of single factor and the orthogonalthe test．The degradation products of crab shell are analysed by TLC．The results showed that the optimum conditions of degradation of crab shell by ly

7、sozyme are a temperature of 55 ℃and pH 5.2，enzyme concentration of 0.50 mg</p><p>　　Keywords: lysozyme；crab shell；degradation；chitooligosaccharide</p><p><b>　　前言</b></p><p

8、>　　甲殼素又名幾丁質(zhì)，是由2-N-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖以β-l，4糖苷鍵縮合而成的多糖類生物大分子，廣泛存在于自然界的昆蟲類、甲殼類和軟體動(dòng)物骨骼以及某些真菌的細(xì)胞壁中。地球蘊(yùn)藏量豐富，每年產(chǎn)量可達(dá)100億噸，是產(chǎn)量?jī)H次于纖維素的第二大天然有機(jī)物，也是數(shù)量?jī)H次于蛋白質(zhì)的含氮有機(jī)物，是地球上一大取之不盡用之不竭的可再生天然資源[1,2]。</p><p>　　通常蝦蟹殼中甲殼素的含量為20％～30

9、％，無機(jī)物(以碳酸鈣為主)含量為40％，有機(jī)物(主要是蛋白質(zhì))含量為30％左右[3]。以前的研究報(bào)道中均是加入大量酸堿去掉這兩類質(zhì)，生產(chǎn)過程產(chǎn)生大量的高濃度酸堿廢液，嚴(yán)重環(huán)境污染而無法投入實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。此外，幾丁質(zhì)在絕大部分溶劑中處于難溶狀態(tài)，而低聚殼聚糖水溶性好，無毒，易被人體吸收。近年來，低聚殼聚糖在保健食品、醫(yī)用藥劑和化妝品方面得到了廣泛的應(yīng)用[4]。大量的研究表明，低聚殼聚糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗菌、降血脂、降血糖、保濕及促

10、進(jìn)植物抗逆生長(zhǎng)等多種生理功能，在功能食品、醫(yī)藥保健、日用化妝品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有良好的研究?jī)r(jià)值[5]。</p><p>　　殼寡糖制備方法除了化學(xué)法外，還有酶解法、物理法、糖基轉(zhuǎn)移法。其中，酶解法是利用特定的酶對(duì)殼聚糖或幾丁質(zhì)進(jìn)行降解的方法，其反應(yīng)條件有諸多優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)條件溫和，無副反應(yīng)，且產(chǎn)品均一性好、聚合度適中，高效、節(jié)能、無污染。所以，近年來國內(nèi)外對(duì)酶法制備殼寡糖的研究較多，包括酶的特性、產(chǎn)酶的微生物及酶的分子

11、生物學(xué)等方面[6]。酸降解工藝簡(jiǎn)單且產(chǎn)量高，但降解產(chǎn)物分子量分布較寬、污染大；酶降解后降解產(chǎn)物分子量分布容易被控制，但分離純化難降解成本高[7]。鑒于上述兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，本文主要通過實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模實(shí)驗(yàn)研究化學(xué)法、酶法聯(lián)合制備幾丁寡糖的最佳工藝條件，使得到的產(chǎn)物分子量單一、產(chǎn)量盡可能高且對(duì)環(huán)境污染小，為幾丁寡糖的制備提供一個(gè)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論基礎(chǔ)。</p><p>　　1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與方法</p>&

12、lt;p><b>　　1.1 儀器</b></p><p>　　可變速高速旋轉(zhuǎn)粉碎機(jī)（Fritsch公司）；全波段酶標(biāo)儀（Thermo公司）；Anker TDL-5臺(tái)式離心機(jī)（廈門精藝興業(yè)科技有限公司）；SHB-Ⅲ 循環(huán)式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；FA-2104型電子天平（上海衡平儀器儀表廠）；微量進(jìn)樣器（寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠）；標(biāo)準(zhǔn)篩（篩號(hào)：100，方孔：0.154nm）

13、。</p><p>　　1.2 主要材料與試劑</p><p>　　胰蛋白酶(300U/mg，上海生工生物工程股份有限公司）；溶菌酶(70000U/mg，上海生工生物工程股份有限公司）；蟹殼（泉州沿海蟹殼）；殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品（單糖～殼六糖，上?；菡\生物科技有限公司）；HAc-NaAc 緩沖液（實(shí)驗(yàn)室自制pH 5.0～6.4）；其它藥品為國產(chǎn)分析純。</p><p>　　

14、1.3 DNS試劑的配制</p><p>　　甲液：將6.9 g結(jié)晶苯酚溶于15.2 mL 10% NaOH溶液，蒸餾水稀釋至69 mL，在此溶液中加入6.9 g亞硫酸氫鈉。乙液：將255 g酒石酸鉀鈉溶于300 mL 10% NaOH溶液中，再加入880 mL 1%的3，5-二硝基水楊酸溶液。將甲乙二溶液混合即得黃色試劑，儲(chǔ)于棕色瓶中放置7～10天后使用。</p><p><b&g

15、t;　　1.4 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　1.4.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制</p><p>　　按表 1方案，各試管取適量1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水，加入1.5 mL DNS試劑。搖勻后沸水浴5 min，取出后迅速冷卻至室溫。分別取0.7 mL反應(yīng)后的溶液并加水稀釋至5 mL，混勻[8]。用0號(hào)管液體作參比液調(diào)零，在520 nm波長(zhǎng)下，讀取吸光度值A(chǔ)。以吸光度

16、值為縱坐標(biāo)，葡萄糖相當(dāng)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 1)?；貧w得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.4629X-0.0495 ，R2=0.9998。</p><p>　　表 1 各試管加溶液和試劑的量</p><p>　　1.4.2 還原糖含量的測(cè)定</p><p>　　分別取出0.4 mL的蝦殼酶解液，再加0.3 mLDNS，沸水浴5 min后，加蒸餾水稀釋至5 mL，于52

17、0 nm測(cè)定吸光度值A(chǔ)(OD520nm ) 。用同法處理煮沸滅活的酶液，作為空白對(duì)照。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出相應(yīng)的還原糖含量。</p><p>　　1.4.3單因素法實(shí)驗(yàn)方法 </p><p>　　影響甲殼素降解的因素主要有反應(yīng)溫度、pH、酶濃度、時(shí)間。依次改變其中的一個(gè)因素進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，記錄各因素水平下的吸光度值，作曲線以找到單個(gè)因素下的最佳條件。</p><p&g

18、t;　　1.4.4正交實(shí)驗(yàn)方法</p><p>　　根據(jù)單因素法確定影響溶菌酶酶解效果的主要因素，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)的因素、水平，按設(shè)計(jì)好的正交試驗(yàn)表來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)找出溶菌酶降解蟹殼的最佳工藝條件。采用SPSS 16.0軟件對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差的單變量分析。</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果</b></p><p>　　2.1 化學(xué)法處理蟹殼&

19、lt;/p><p>　　將蟹殼清洗干凈，除掉殘留的蟹肉、邊角及薄膜，烘干。用研缽初步搗碎，然后用粉碎機(jī)粉碎過100目篩，加10%的醋酸溶液（10mL/g），脫鈣24小時(shí)，抽濾，水洗沉淀三次。將濾渣轉(zhuǎn)移到燒杯中，加蒸餾水并用稀氨水調(diào)pH=7.5，加入胰蛋白酶（1000U/g）于50℃水浴[9]2h, 兩次脫蛋白后進(jìn)行抽濾，水洗沉淀至中性并烘干。</p><p>　　表 2 化學(xué)法提取甲殼素的產(chǎn)率

20、分析表</p><p>　　2.2 單因素法考察溶菌酶降解甲殼素粗品制備幾丁寡糖的條件</p><p>　　2.2.1 pH值對(duì)酶解效果的影響</p><p>　　在1.8 mL pH分別為5.2，5.4，5.6，5.8，6.0，6.2，6.4的HAc-NaAc緩沖液中，各加入0.05g處理后的蟹殼粉及0.2 mL 4.5 mg/mL溶菌酶液混合，50 ℃水浴反應(yīng)3

21、 h，可以測(cè)出一系列不同pH下溶菌酶與蟹殼作用后溶液中還原糖的吸光度。酶解pH與酶解液還原糖濃度相關(guān)性見圖 2，由圖 2可知溶菌酶降解蟹殼的最適pH為5.6。</p><p>　　2.2.2 酶濃度對(duì)酶解效果的影響</p><p>　　0.05g處理后的蟹殼粉，1.8 mLHAc-NaAc緩沖液(pH 5.6)，分別加入溶菌酶液濃度分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.

22、5mg/mL各0.2 mL，置于50 ℃水浴反應(yīng)3 h后測(cè)還原糖含量。可以測(cè)出一系列不同酶濃度與蟹殼作用后溶液中還原糖的吸光度。具體結(jié)果見圖 3。由圖可見，溶菌酶降解蝦殼的最佳濃度為0.45 mg/mL。隨著酶濃度的增加，酶解效果反而降低，可能是降解產(chǎn)物抑制溶菌酶活性。</p><p>　　2.2.3 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響</p><p>　　將0.2 mL 4.5 mg/mL溶菌酶液與0

23、.05g處理后的蟹殼粉，1.8 mLHAc-NaAc緩沖液(pH 5.6)于50 ℃下分別反應(yīng)2、3、4、5、6、7、8 h。測(cè)出各條件下酶解產(chǎn)物的吸光度。結(jié)果見圖 4，開始2~3 h酶解產(chǎn)物濃度無顯著變化，隨后酶解產(chǎn)物濃度隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)快速升高，當(dāng)酶解時(shí)間到5 h時(shí)，出現(xiàn)平臺(tái)，說明時(shí)間對(duì)酶解效果的影響趨于穩(wěn)定，所以溶菌酶降解蟹殼的所需的反應(yīng)時(shí)間為5 h。</p><p>　　2.2.4 溫度對(duì)酶解反應(yīng)速度的影

24、響</p><p>　　在35～65℃的溫度范圍內(nèi)，將0.05g處理后的蟹殼粉，1.8 mLHAc-NaAc緩沖液(pH 5.6)與0.2 mL 4.5 mg/mL溶菌酶作用3 h后，測(cè)定酶解后還原糖相對(duì)濃度，考察酶解溫度對(duì)酶解效果的影響。結(jié)果見圖 5，由圖可見，溫度對(duì)酶解效果影響呈鐘罩形，溶菌酶活性隨著溫度的升高而增大，而當(dāng)溫度升高到55℃時(shí)，溶菌酶活性達(dá)到最大，降解蟹殼的效果最好，隨著溫度的繼續(xù)升高，溶菌酶失

25、活變性，降解蟹殼的效果也隨之降低。由此也可見酶的反應(yīng)條件一定要溫和。溫度對(duì)酶活性的影響具有雙重性，隨著溫度的逐漸升高一方面加快催酶促反應(yīng)的速度，另一方面逐漸促使酶蛋白變性，最適宜溫度是兩種對(duì)抗性的綜合效果。</p><p>　　2.3 溶菌酶降解蟹殼的正交實(shí)驗(yàn)</p><p>　　表 3 溶菌酶降解蟹殼正交實(shí)驗(yàn)表</p><p>　　在3個(gè)因素中，溫度的3水平最好、

26、酶濃度的3水平最好、pH 值的1 水平最好。由此得出最佳反應(yīng)條件的溫度為55 ℃，酶濃度0.50 mg/ml，pH5.2。由R可得，溫度對(duì)溶菌酶降解蟹殼的影響最大，其次是pH對(duì)降解效果的影響，溶菌酶濃度對(duì)降解效果的影響最小。</p><p>　　2.4 最佳條件下的降解實(shí)驗(yàn)</p><p>　　按正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳反應(yīng)條件的溫度為55 ℃，酶濃度0.50 mg/ml，pH5.2。再此條件下

27、做三次平行試驗(yàn)，求殼寡糖平均值并計(jì)算產(chǎn)率。</p><p>　　表4溶菌酶降解甲殼素的產(chǎn)率分析表</p><p>　　2.5 蟹殼降解產(chǎn)物的TLC分析</p><p>　　將配制好的展開劑（乙酸∶正丁醇∶水=2∶2∶1）倒入展開缸，以距硅膠板底端1.5 cm為準(zhǔn)，飽和2 h以上。硅膠板放入105℃烘箱中，活化1 h，在距硅膠板頂端1.0 cm處劃線。在距硅膠板底端1

28、.5 cm處，用10 μL微量進(jìn)樣器小心點(diǎn)樣，點(diǎn)樣點(diǎn)不能超過直徑1 mm，烘干。硅膠板置于展開缸，蓋好展開缸蓋，展層，直到前端到達(dá)距終點(diǎn)端1.0 cm，取出硅膠板，于254 nm紫外光下觀察，拍照。烘干后噴霧顯色（顯色劑為鄰苯二甲基苯胺：0.93 g苯胺，1.66 g鄰苯二甲酸溶于100 ml水飽和的正丁醇中），噴霧須呈輕微霧狀，置于105℃恒溫干燥箱小心烘干10 min直至樣品顯色[10]。 </p><p>

29、　　如圖 6所示，結(jié)果表明，在TLC板上樣品展層速度按分子量從小到大排列，依次是單糖、殼二糖至殼六糖，水解產(chǎn)物中沒有更大分子量的幾丁寡糖產(chǎn)生，水解產(chǎn)物主要是幾丁二糖。</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　降解產(chǎn)物中還原糖是蟹殼降解的一個(gè)重要指標(biāo)，其多少直接標(biāo)志著蟹殼的降解程度，因此，用還原糖來表征降解反應(yīng)的程度。溶菌酶降解蟹殼的產(chǎn)物主要是

30、聚合度低的幾丁二糖。</p><p>　　蟹殼先利用醋酸脫鈣、胰蛋白酶脫蛋白，然后用溶菌酶降解，所有試劑都溫和不刺激，可避免環(huán)境污染的發(fā)生。通過一系列的實(shí)驗(yàn)確定了溶菌酶降解蟹殼在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模實(shí)驗(yàn)中的最佳酶加入量、最適反應(yīng)溫度、pH值和時(shí)間。用TLC檢測(cè)水解產(chǎn)物中主要得到的是幾丁二糖。與文獻(xiàn)[12]中降解殼聚糖的實(shí)驗(yàn)比較，最佳反應(yīng)條件以及降解產(chǎn)物均不同。溶菌酶降解殼聚糖的產(chǎn)物主要是聚合度為三以上的殼寡糖，減少了低聚

31、合度寡糖的生成。而本實(shí)驗(yàn)的降解產(chǎn)物主要是低聚合度的幾丁二糖，增加了低聚合度糖的生成。主要原因是降解的底物不一樣，從蟹殼提取的甲殼素未進(jìn)行脫乙酰化操作，反應(yīng)條件相對(duì)溫和。 </p><p>　　甲殼素在自然界中具有非常豐富的資源，幾丁寡糖溶解性好、分子量小、易于吸收。隨著人們?cè)絹碓缴钊氲难芯?，幾丁寡糖越來越多的性質(zhì)、功能被人們發(fā)現(xiàn)，顯示出它市場(chǎng)潛力大，引起國內(nèi)外的關(guān)注。隨著甲殼素的實(shí)驗(yàn)室研究逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楣I(yè)化發(fā)展的實(shí)

32、現(xiàn)，這一生物物質(zhì)必將被充分利用，具有環(huán)保、安全、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)的寡糖產(chǎn)品將會(huì)在人們的生活中發(fā)揮更大作用。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　Togawa,T，Nakato，H．&Izumi，S．Analysis of the chitin recognition mechanism of cuticle proteins from

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38、大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23(6)：90～93．</p><p><b>　　致謝：</b></p><p>　　本研究及學(xué)位論文是在我的導(dǎo)師謝XX副教授的親切關(guān)懷和悉心指導(dǎo)下完成的。她嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，精益求精的工作作風(fēng)，深深地感染和激勵(lì)著我。從課題的選擇到項(xiàng)目的最終完成，謝老師都始終給予我細(xì)心的指導(dǎo)和不懈的支持。在此謹(jǐn)向謝老師致以誠摯的謝意和崇高的敬意。 </p&