根霉與米曲霉原生質(zhì)體一次基因組改組選育高酶活力菌株研究【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　根霉與米曲霉原生質(zhì)體一次基因組改組選育高酶活力菌株研究</p><p><b>　　摘 要&l

2、t;/b></p><p>　　為了提高酒、醬油和醬類的生產(chǎn)效率，節(jié)約糧食，降低成本，本實驗通過對根霉與米曲霉原生質(zhì)體誘變后的篩選高酶活力菌株進行的原生質(zhì)體制備、雙親滅活、融合、再生后代融合菌株。并對一、三、五、七代以及親本在生長時的形態(tài)特征進行觀察分析，且測了蛋白酶和淀粉酶的活力，最后對其進行SDS電泳分析。結(jié)果表明親本和其雜交后代在培養(yǎng)基上生長都比較旺盛，菌體形狀大多呈圓形，顏色逐漸加深，后代蛋白酶酶的

3、活力普遍高于親本，而淀粉酶的活力與親本相似。例如：測蛋白酶Hc中親本根霉5%的顯著差異為c，1%的顯著差異為C，米曲霉5%的顯著差異為c，1%的顯著差異為BC，而融合三代B5%的顯著差異為ab，1%的顯著差異為AB,融合五代A5%的顯著差異為a，1%的顯著差異為A。淀粉酶中親本與后代的5%的顯著差異基本為ab，1%的顯著差異為A。用Tris對菌絲提取蛋白質(zhì)后進行電泳，發(fā)現(xiàn)后代的條帶與親本差異很大，說明后代與親本存在一定差異。</p

4、><p>　　關(guān)鍵詞：滅活；誘變；原生質(zhì)體融合；酶活；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 </p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　In order to improve the wine, soy sauce and sauce production efficiency, save food, reduce costs

5、, the present study, and Rhizopus oryzae on Mutagenesis and screening of high enzyme activity after the strains of protoplast formation, parents killed, integration, Integration of renewable future strains. And one, thre

6、e, five, seven generations, and parents in growth was observed when the analysis of morphological characteristics, and measuring the protease and amylase, and finally its SDS electroph</p><p>　　Key words: In

7、activation; mutagenesis; protoplast fusion; activity; SDS-polyacrylamide gel electrophores</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言3</b></p><p>　　1.1 研究現(xiàn)狀3<

8、;/p><p>　　1.2 目的與意義3</p><p><b>　　2 材料和方法4</b></p><p>　　2.1 基因組改組4</p><p>　　2.1.1 菌株4</p><p>　　2.1.2 原生質(zhì)體制備所需的酶類4</p><p>　　2.1.3

9、培養(yǎng)基配置4</p><p>　　2.1.4 試劑與儀器4</p><p>　　2.1.5 主要溶液試劑及配制5</p><p>　　2.1.6 其他材料6</p><p>　　2.1.7 實驗方法6</p><p>　　2.2 傳代培養(yǎng)7</p><p>　　2.2.1 形態(tài)觀察

10、7</p><p>　　2.2.2 酶活測定7</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析8</b></p><p>　　3.1 高酶活力菌株篩選8</p><p>　　3.2 后代形態(tài)分析8</p><p>　　3.2.1 平板培養(yǎng)基觀察結(jié)果8</p><p>

11、　　3.2.2 透明圈培養(yǎng)基觀察結(jié)果10</p><p>　　3.3 蛋白質(zhì)含量分析17</p><p>　　3.3.1掃描圖17</p><p>　　3.3.2 蛋白質(zhì)定量分析18</p><p>　　3.3.3 定量檢驗報告表18</p><p>　　3.4 蛋白質(zhì)帶分析23</p>&l

12、t;p>　　3.5 泳道中帶分布報告24</p><p>　　3.6 列相似性分析26</p><p>　　3.6.1 相似性圖表26</p><p>　　3.6.2 親本及其后代的聚類分析27</p><p><b>　　4 小結(jié)27</b></p><p><b>　

13、　參考文獻28</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p><b>　　1.1 研究現(xiàn)狀</b></p><p>　　原生質(zhì)體融合技術(shù)(Protoplast Fusion)是將遺傳性狀不同的兩個細胞融合為一個新細胞，使兩親株的整套基因相互重新組合的一種技術(shù)，屬于細胞工程。它是現(xiàn)代生化

14、技術(shù)的一個分支，起源于20世紀60年代[1]。1960年法國的Karski研究小組在兩種不同類型的動物細胞的混合培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了自發(fā)融合現(xiàn)象。同時,日本的Okada發(fā)現(xiàn)并證明了仙臺病毒可誘發(fā)內(nèi)艾氏腹水癌細胞彼此融合,從而開始了細胞融合的探討[2]。</p><p>　　現(xiàn)在原生質(zhì)體融合技術(shù)在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用產(chǎn)生的效益。已是舉世矚目，它已成為高新技術(shù)開發(fā)的重要領(lǐng)域。該技術(shù)不僅為核質(zhì)相互關(guān)系、基因調(diào)控、遺傳互補、腫瘤發(fā)生

15、，基因定位、衰老控制理念等領(lǐng)域的研究都提供了有力的手段，而且在遺傳學(xué)、動植物遠緣雜交育種、發(fā)生生物學(xué)、免疫醫(yī)學(xué)以及醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等方面都有廣泛的應(yīng)用價值[3]。通過原生質(zhì)體融合進行細胞雜交已成為細胞工程研究的重要內(nèi)容之一。而且在獸醫(yī)預(yù)防科學(xué)領(lǐng)域也已有原生質(zhì)體融合的研究，主要目的是為了把不同免疫原性的菌株集中于同一菌株上，對血清型多而又元交叉免疫保護的病原菌研制多價疫苗時，有利于提高疫苗中單因子的單位抗原含量，達到提高免疫效果的目的[4

16、]。如于鳳剛等研究禽巴氏桿菌雙型融合株、禽巴氏桿菌與大腸埃希菌的雙型融合株、禽大腸埃希菌雙型融合株等。目前所進行的關(guān)于原生質(zhì)體融合的研究僅僅局限于兩個菌株之間的融合，沒有擴展到3個以上菌株之間的融合，如果我們能夠開展多個菌株之間的融合，則有可能獲得同時具有多個優(yōu)良性狀的菌株，進一步拓寬這一技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。</p><p><b>　　1.2 目的與意義</b></p><

17、p>　　釀造產(chǎn)品利用微生物發(fā)酵在我國已有幾千年的歷史，但是普遍的純粹培養(yǎng)以及誘變育種僅僅只有20多年的時間。</p><p>　　根霉在自然界分布很廣，用途廣泛，其淀粉酶活性很強，是釀造工業(yè)中常用糖化菌。我國最早利用根霉糖化淀粉（即阿明諾法）生產(chǎn)酒精。根霉能生產(chǎn)延胡索酸、乳酸等有機酸，還能產(chǎn)生芳香性的酯類物質(zhì)[5]。</p><p>　　米曲霉是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可

18、產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，將原料中的直鏈、支鏈淀粉降解為糊精及各種低分子糖類，如麥芽糖、葡萄糖等。在蛋白酶的作用下，將不易消化的大分子蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、多肽及各種氨基酸，而且可以使輔料中粗纖維、植酸等難吸收的物質(zhì)降解，提高營養(yǎng)價值、保健功效和消化率，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、生產(chǎn)曲酸、釀酒等發(fā)酵工業(yè)，并已被安全地應(yīng)用了1000多年。米曲霉是理想的生產(chǎn)大腸桿菌不能表達真核生物活性蛋白的載體，米曲霉基因組所包含的

19、信息可以用來尋找最適合米曲霉發(fā)酵的條件，這將有助于提高食品釀造業(yè)的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。米曲霉基因組的破譯，也為研究由曲霉屬真菌引起的曲霉病提供了線索。</p><p>　　根霉與米曲霉的優(yōu)劣不僅直接影響酒、醬油和醬類的出品率，而且也關(guān)系到提高產(chǎn)品質(zhì)量，食品衛(wèi)生和風(fēng)味的好壞，據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年用于釀造醬油幾及醬類的糧食10多億，如選擇優(yōu)良菌種提高利用率2%就能節(jié)糧2000萬斤，所以誘變育種是與釀造工業(yè)的發(fā)展、節(jié)

20、約糧食和人民生活有著密切的關(guān)系[6]。</p><p><b>　　2 材料和方法</b></p><p><b>　　2.1 基因組改組</b></p><p><b>　　2.1.1 菌株</b></p><p>　　根霉(Rhizopus)、米曲霉（Aspergillus

21、 oryzae）。（均由萬里學(xué)院提供）。</p><p>　　2.1.2 原生質(zhì)體制備所需的酶類 </p><p>　　纖維素酶(Cellulase)：購自上海伯奧生物技術(shù)有限公司</p><p>　　溶壁酶(Lywallzyme)：購自廣東微生物研究所。 </p><p>　　蝸牛酶 (Snailase)：購自北京百泰生物技術(shù)有限公司。&l

22、t;/p><p>　　2.1.3 培養(yǎng)基配置</p><p>　　馬鈴薯固體培養(yǎng)基（PDA）：取一定量的馬鈴薯、洗凈、去皮、切塊，稱取100g左右放入煮沸的蒸餾水中（約500mL左右），20min后取浸出液，加入葡萄糖10g，瓊脂粉10g，牛肉膏2g，定容為500mL的固體培養(yǎng)基。</p><p>　　牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨15g，瓊脂7.5g，淀粉1g

23、，加蒸餾水定容到500ml。</p><p>　　酪蛋白水解培養(yǎng)基：Na2HPO4?7H20 1.07g，KH2PO4 0.36g，酪蛋白10g瓊脂粉15g，加蒸餾水定容到1000mL。</p><p>　　以上培養(yǎng)基配置都為自然pH值，于0.1Mpa條件下滅菌20min。</p><p>　　2.1.4 試劑與儀器</p><p>　　表1

24、 主要化學(xué)藥品和試劑</p><p>　　表2 主要儀器和設(shè)備</p><p>　　2.1.5 主要溶液試劑及配制</p><p>　?。?）30%丙烯酰胺貯存液：稱取丙烯酰胺29g，甲叉雙丙烯酰胺1g，加蒸餾水至100mL，裝于棕色瓶于4℃并向保存?zhèn)溆茫?lt;/p><p>　?。?）SDS-分離膠緩沖液，1.5mol/LTris-HCL

25、，pH為8.8，加入0.4%SDS。</p><p>　?。?）SDS-濃縮膠緩沖液：0.5mol/LTris-HCL，pH為6.8，加入0.4%SDS。</p><p>　?。?）SDS-電極緩沖液：0.025mol/LTris，0.192mol/L甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3。</p><p>　?。?）分離膠：配置比例為10%，其中10%SDS 0.

26、4mL，30%丙烯酰胺貯存液13.2mL，10%過硫酸銨0.4mL，加水16mL，抽氣后，加入TEMED21μL，迅速混勻倒入兩玻璃板之間（占玻璃板高度的2/3），上層用噴霧器覆蓋一水層，讓其聚合30min。</p><p>　?。?）濃縮膠：配置比例為5%，其中10%SDS 0.1mL，1MTris（pH6.8）1.26Ml，30%，丙烯酰胺貯存液1.66mL，10%過硫酸銨溶液100μL，加水6.8mL，加入

27、TEMED15μL，迅速混勻倒在制備好的分離膠上，并插入樣品槽模板，上層用噴霧器覆蓋一水層，聚合30min。</p><p>　?。?）Tris提取液：12.114g Tris蒸餾水定溶到100mL，用HCl調(diào)節(jié)pH至6.8[7]。</p><p>　　2.1.6 其他材料</p><p>　　移液槍、離心管、玻璃棒、燒杯、量筒、移液管、槍頭、蒸餾水、一次性手套、M

28、olecular Imager GS-800 Calibrated Densitometer、Quantity one電泳分析軟件等。</p><p>　　2.1.7 實驗方法</p><p><b>　　（1）菌種活化</b></p><p>　　將預(yù)先保留下來的兩種菌種在超凈工作臺上分別接種到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上，接種完成后倒置放于30℃恒

29、溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3-5d。</p><p><b>　?。?）菌絲制備</b></p><p>　　取已經(jīng)活化好的兩種菌種的平板，在平板中生成的菌落邊緣全為白色的菌絲部分打1mm菌餅若干，接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，置于電磁恒溫搖床中32℃100r/min條件下培養(yǎng)。</p><p><b>　?。?）誘變</b><

30、/p><p>　　取0.2ml菌懸液涂布完全培養(yǎng)基中，在紫外透射反射儀中254nm下進行紫外線誘變。照射時間設(shè)為15min。照射后封蓋黑布包裹置于30℃的培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)36h[6]。之后放到選擇培養(yǎng)基里培養(yǎng)，選取高酶活力的菌落。</p><p>　?。?）原生質(zhì)體的制備與再生 </p><p>　　菌絲培養(yǎng)：刮取培養(yǎng)基上生長旺盛的根霉與米曲霉孢子制得孢子懸液，取

31、新鮮的孢子懸液 (108個/mL) 0.1mL接種于盛有50mL菌絲生長培養(yǎng)基的三角瓶中，并在 32oC、150r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)15h。 </p><p>　　酶液配置：選取現(xiàn)階段在根霉與米曲霉原生質(zhì)體制備中常用的3種酶，即纖維素酶、溶壁酶、蝸牛酶混合使用酶解細胞壁以分離制備原生質(zhì)體。通過正交試驗得到3種酶的最佳配比為7：3：1，并以PBA溶液 (含0.4mol/L NH4C1的0.2mol/L磷酸緩沖

32、溶液，pH6)配制，濾膜除菌后于4℃冰箱過夜。</p><p>　　原生質(zhì)體制備：通過離心將菌絲與培養(yǎng)基分離，用滲透壓穩(wěn)劑 (0.8moL/L NaC1溶液)離心洗滌(3000r/min、5min)2次，洗滌后置于離心管中，加入酶液，32℃恒溫水浴中振蕩酶解。2.5h后4層高級擦鏡紙過濾，濾液于3000r/min離心分離10min，并用滲穩(wěn)劑溶液離心洗滌3次，收集原生質(zhì)體重懸于0.8mol/LNaC1溶液中。 &

33、lt;/p><p>　　原生質(zhì)體再生：將所得原生質(zhì)體懸浮液用0.8mol/LNaC1溶液梯度稀釋至適當(dāng)濃度后取lmL分別接種CM平板和高滲CM平板，用公式(1)計算再生率：</p><p>　　（5） 原生質(zhì)體滅活 </p><p>　　取根霉原生質(zhì)體懸液(106個/mL)適量于無菌離心管內(nèi)，置于60℃恒溫水浴箱中熱滅活15min取出。取米曲霉原生質(zhì)體懸液 (106個/

34、mL)適量于無菌平皿內(nèi)，距15W紫外燈5 cm處，照射5min取出。</p><p>　?。?）原生質(zhì)體融合 </p><p>　　原生質(zhì)體融合過程中PEG(6000)百分比濃度及溶液pH值的選擇：配置PEG(6000)濃度為35％的溶液，該種溶液調(diào)pH值為7.5，配備好的溶液取10mL置于無菌離心管內(nèi)。管中分別取等量米曲霉和根霉滅活原生質(zhì)體懸液，輕拍使溶液混合均勻5min后滲透壓穩(wěn)定劑高

35、度稀釋并低溫離心洗滌。</p><p>　　滅活原生質(zhì)體融合：將滅活后的原生質(zhì)體懸浮液在所得最佳 PEG(6000)濃度在溶液pH值的條件下融合5min。融合后取lmL懸浮液接種到高滲CM平板上，恒</p><p>　　溫箱28％培養(yǎng)48h觀察結(jié)果，并按公式 (2)計算融合率：</p><p>　　式中：平板A為融合后接種的高滲平板，平板B為滅活前雙親等量混合后接種

36、的高滲平板[8]。</p><p><b>　　2.2 傳代培養(yǎng)</b></p><p>　　將融合的菌種接種到馬鈴薯固體培養(yǎng)基上，澆制3個，即第一代。30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)二天后取一點接種第二代，并在另一點蓋一蓋玻片，再培養(yǎng)一天，用于觀察形態(tài)特征，最后一點接種到斜面培養(yǎng)基上保存菌種。按這個步驟接種到第七代。</p><p>　　2.2.1 形態(tài)

37、觀察</p><p>　　觀察平板培養(yǎng)基上菌落的蔓延狀況、疏松程度，表面濕潤或干燥，有無光澤，隆起形狀，邊緣的整齊度、大小、顏色等。</p><p>　　顯微鏡觀察菌種的形狀及出芽方式，仔細觀察孢子囊、假根、菌絲等的生長情況，并繪圖。</p><p>　　2.2.2 酶活測定</p><p><b>　?。?）蛋白酶活測定</

38、b></p><p>　　將融合后的菌株接種在蛋白酶選擇培養(yǎng)基上，28oC培養(yǎng)48h，測定其透明圈直徑與菌落直徑的比值(Hc)，以Hc值比較蛋白酶活力的高低[9]。</p><p><b>　?。?）淀粉酶活測定</b></p><p>　　將融合后的菌株接種在淀粉酶選擇培養(yǎng)基上，28oC培養(yǎng)48h，測定其透明圈直徑與菌落直徑的比值(Hc

39、)，以Hc值比較蛋白酶活力的高低。</p><p><b>　?。?）蛋白質(zhì)提取</b></p><p>　　將親本、一、三、五、七代菌株分別從固體培養(yǎng)基上刮取一定量的菌絲，加1ml的Tris提取液，在用液氮使勁的研磨5分鐘，將混合液移置離心管中離心，取上清液保存與零下20oC的冰箱中。</p><p>　?。?）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及分

40、析</p><p>　　提取得到的蛋白質(zhì)與等量的SDS-樣品緩沖液混合100oC加熱10分鐘預(yù)處理，移液槍移取50μL進行點樣。電泳初期使用120V的穩(wěn)壓電泳，當(dāng)進入分離膠后電壓加到180V進行電泳。電泳結(jié)束之后取出膠板置于染色液中染色20min左右后進行脫色，脫色完成后，將電泳得到的圖譜通過GS-800 Calibrated Densitometer進行掃描，之后將得到掃描圖運用Quantity one軟件進行

41、分析[10]。在Quantity one軟件中，首先進行圖像顯示優(yōu)化，再使用定量邊界工具，勾畫出各電泳條帶的邊界，創(chuàng)建定量標準對條帶進行定量分析，并得到定量檢驗報告，再用Band工具中的Detect bands生成條帶，再用帶匹配工具得到帶匹配圖，再生成帶分布報告，最后用列相似性工具處理得到列相似性圖表。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p&

42、gt;　　3.1 高酶活力菌株篩選</p><p>　　原生質(zhì)體融合后，將培養(yǎng)基內(nèi)的的菌落分別接種到蛋白酶選擇培養(yǎng)基和淀粉酶選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3天，比較透明圈與菌落比值的大小，分別選取最大的三組標號為A、B、C進行傳代培養(yǎng)。</p><p>　　3.2 后代形態(tài)分析</p><p>　　3.2.1 平板培養(yǎng)基觀察結(jié)果</p><p>　　圖

43、1 親本根霉圖2 親本米曲霉</p><p>　　圖3 融合一代a 圖4 融合一代b圖5 融合一代c</p><p>　　圖6 融合三代a圖7 融合三代b圖8 融合三代c</p><p>　　圖9 融合五代a圖10 融合五代b圖11 融合五代c</p><p>　　圖12 融合七代a圖13 融合七代

44、b 圖14 融合七代c</p><p>　　圖1、2為兩個親本，從圖3到圖14是融合后代，親本和后代菌落生長都較快，且比較密集，形狀基本都接近圓形，但顏色過渡較慢，逐步呈現(xiàn)淡黃色，整體感覺光鮮明亮，隨著培養(yǎng)時間的推移菌絲的逐漸變稀并但不是非常明顯，分生孢子逐漸增多，表面顏色開始變成淡的灰黑色，在菌落表面有少量絨毛。從圖9、10、11可以看出有大量孢子產(chǎn)生。</p><p&

45、gt;　　3.2.2 透明圈培養(yǎng)基觀察結(jié)果</p><p>　　圖15 融合一代a淀粉酶 圖16 融合一代b淀粉酶 圖17 融合一代c淀粉酶</p><p>　　圖18 融合三代a淀粉酶 圖19融合三代b淀粉酶圖20 融合三代c淀粉酶</p><p>　　圖21 融合五代a淀粉酶 圖22 融合五代b淀粉酶 圖

46、23 融合五代c淀粉酶</p><p>　　圖24 融合七代a淀粉酶 圖25 融合七代b淀粉酶 圖26 融合七代c淀粉酶</p><p>　　圖27 融合一代a蛋白酶 圖28 融合一代b蛋白酶 圖29 融合一代c蛋白酶</p><p>　　圖30 融合三代a蛋白酶 圖31 融合三代b蛋白酶

47、 圖32 融合三代c蛋白酶 </p><p>　　圖33 融合五代a蛋白酶圖34 融合五代b蛋白酶圖35 融合五代c蛋白酶</p><p>　　圖36 融合七代a蛋白酶 圖37 融合七代b蛋白酶 圖38 融合七代c蛋白酶 3.3 數(shù)據(jù)分析</p><p>　　表3 根霉蛋白酶數(shù)據(jù)</p><p&g

48、t;　　表4 米曲霉蛋白酶數(shù)據(jù)</p><p>　　表5 融合第一代蛋白酶數(shù)據(jù)</p><p><b>　　續(xù)表5</b></p><p>　　表6 融合第三代蛋白酶數(shù)據(jù)</p><p>　　表7 融合第五代蛋白酶數(shù)據(jù)</p><p><b>　　續(xù)表7</b><

49、;/p><p>　　表8 根霉淀粉酶數(shù)據(jù)</p><p>　　表9 米曲霉淀粉酶數(shù)據(jù)</p><p>　　表10 融合第一代淀粉酶數(shù)據(jù)</p><p>　　表11 融合第三代淀粉酶數(shù)據(jù)</p><p>　　表12 融合第五代淀粉酶數(shù)據(jù)</p><p>　　表13 融合第七代淀粉酶數(shù)據(jù)&l

50、t;/p><p><b>　　續(xù)表13</b></p><p>　　表14 不同菌種的蛋白酶Hc</p><p>　　由表13可知融合三代B與融合五代A蛋白酶的活性最高，融合三代A、融合三代C與融合五代C次之，且三者活性相差不多，然后是融合一代，親本米曲霉與根霉活性最低。從表中可以看出融合體一代蛋白酶的活性近似親本米曲霉的活性，但融合三代、五代酶

51、活普遍比親本高，而且有逐漸增大的趨勢。本實驗中培養(yǎng)到七代的時候沒有透明圈的出現(xiàn)，可能是由于菌株發(fā)生變異導(dǎo)致蛋白酶活急劇降低。</p><p>　　表15 不同菌種的淀粉酶Hc</p><p>　　由表15可知，親本根霉與米曲霉的淀粉酶活性與后代相比沒有顯著的差異，基本相似，只有融合七代B與融合七代C活性稍微降低。說明本實驗中親本融合之后對淀粉酶的活性沒有影響。</p>&l

52、t;p>　　3.3 蛋白質(zhì)含量分析</p><p><b>　　3.3.1掃描圖</b></p><p><b>　　圖39 掃描圖片</b></p><p>　　注：圖中的樣品依次為：根霉、米曲霉、融合一代a、融合一代b、融合一代c、融合三代a、Marker、融合三代b、融合三代c、融合五代a、融合五代b、融合五

53、代c、融合七代a、融合七代b、融合七代c</p><p>　　從上圖中可以發(fā)現(xiàn)同一代中的不同個體條帶的條數(shù)與顏色深度差別各不相同，如融合一代a比融合一代b和融合一代c條帶要多，而融合一代b跟融合一代c條帶差不多。融合三代a比融合三代b和融合三代c條帶要少，而比融合三代b和融合三代c條帶差不多。融合五代跟融合七代比較接近。我認為有以下幾點導(dǎo)致條帶不同的原因所在：第一，融合一代b和融合一代c所接的菌種是一樣的，融合三

54、代b和融合三代c所接的菌種是一樣的；第二，菌種本身有問題，染菌或者變異了；第三，在提取蛋白質(zhì)時，提取不夠充分研磨不完全，時間短；第四，在提取和離心過程中被污染或酶解；第五，電泳前，對樣品處理出現(xiàn)失誤或某些原因?qū)е碌鞍踪|(zhì)含量減少。</p><p>　　3.3.2 蛋白質(zhì)定量分析</p><p>　　圖40 親本以及融合體后代蛋白條帶定量</p><p>　　注：圖中

55、的樣品依次是：G為根霉、M為米曲霉、A為融合一代a、B為融合一代b、C為融合一代c、D為融合三代a、std為Marker、E為融合三代b、F為融合三代c、H為融合五代a、L為融合五代b、P為融合五代c、N為融合七代a、U為融合七代b、K為融合七代c</p><p>　　從定量圖譜中我們可以看到，從親本各條帶顏色深度和融合后代的條帶顏色深度比較中我們可以初步認為融合體后代的蛋白含量與親本是存在差距的。相信除了跟實驗

56、過程中的提取率有關(guān)外，也跟融合體本身的蛋白含量及融合情況也有直接的聯(lián)系。若干條帶拖尾很嚴重，分析是由于電壓過高或設(shè)備密封性不高有關(guān)。</p><p>　　3.3.3 定量檢驗報告表</p><p>　　表16 標樣蛋白定量檢驗報告</p><p><b>　　續(xù)表16</b></p><p>　　表17 根霉蛋白定

57、量檢驗報告</p><p>　　表18 米曲霉蛋白定量檢驗報告</p><p>　　表19 融合一代a蛋白定量檢驗報告</p><p>　　表20 融合一代b蛋白定量檢驗報告</p><p>　　表21 融合一代c蛋白定量檢驗報告</p><p>　　表22 融合三代a蛋白定量檢驗報告</p>&

58、lt;p>　　表23 融合三代b蛋白定量檢驗報告</p><p>　　表24 融合三代c蛋白定量檢驗報告</p><p>　　表25 融合五代a蛋白定量檢驗報告</p><p>　　表26 融合五代b蛋白定量檢驗報告</p><p>　　表27 融合五代c蛋白定量檢驗報告</p><p><b&g

59、t;　　續(xù)表27</b></p><p>　　表28 融合七代a蛋白定量檢驗報告</p><p>　　表29 融合七代b蛋白定量檢驗報告</p><p>　　表 30 融合七代c蛋白定量檢驗報告</p><p><b>　　續(xù)表30</b></p><p>　　從以上數(shù)據(jù)我們不難

60、發(fā)現(xiàn)，兩親本蛋白質(zhì)組的組成和含量與融合后代的蛋白質(zhì)組組成和含量存在很大的差異性。其中G6的Volume OD*mm2為6.1236947568，Adj. Vol.OD*mm2為2.9869119026，% Adj. Vol. OD為5.5646926059，Mean Value為0.2727513003，在后代中如融合三代a電泳得到4條帶，其中D3的Volume OD*mm2為0.9904643931，Adj. Vol.OD*mm2為0

61、.1859877559，% Adj. Vol. OD為0.3464999049，Mean Value為0.1720137571，數(shù)據(jù)表明本實驗得到了不同于親本的融合體，且后代的變異很大，融合后代的蛋白質(zhì)含量都普遍減少。由此判斷兩親本存在著相互排斥和制約，使得后代細胞中的蛋白質(zhì)含量都普遍降低。</p><p>　　后代融合體之間蛋白質(zhì)組成也存在很大的不同，尤其是融合三代a和融合七代c之間的差異比較明顯。如融合三代a

62、電泳得到4條帶，其中D3的Volume OD*mm2為0.9904643931，Adj. Vol.OD*mm2為0.1859877559，% Adj. Vol. OD為0.3464999049，Mean Value為0.1720137571。在融合七代c中電泳得到7條條帶，其中K7的Volume OD*mm2為2.4920550691，Adj. Vol.OD*mm2為1.4104058090，% Adj. Vol. OD為2.62762

63、17822，Mean Value為0.3218910697。可見在傳代過程有新的蛋白質(zhì)生成，不過也些融合后穩(wěn)定性不高的蛋白質(zhì)信息被逐步的去除掉。</p><p>　　3.4 蛋白質(zhì)帶分析</p><p>　　運用Quantity one軟件，對電泳圖譜進行帶匹配操作，在完成該操作后得到了帶匹配圖譜。</p><p><b>　　圖41 帶匹配圖</b

64、></p><p>　　注：圖中的樣品依次為：1為根霉、2為米曲霉、3為融合一代a、4為融合一代b、5為融合一代c、6為融合三代a、7為Marker、9為Marker、10為融合三代b、10為融合三代c、12為融合五代a、13為融合五代b、14為融合五代c、15為融合七代a、16為融合七代b、17為融合七代c</p><p>　　在帶匹配圖譜中，綠色的帶表示被定義的帶，紅色的帶則表示

65、與之相匹配的帶。</p><p>　　3.5 泳道中帶分布報告</p><p>　　注：表中0表示沒有該條帶，1表示有該條帶。</p><p>　　在融合三代c、融合五代a、融合五代b、融合七代a、融合七代b、融合七代c中出現(xiàn)了4號新蛋白，在融合五代b、融合五代c、融合七代c中出現(xiàn)了23號新蛋白，在融合一代b、融合三代b、融合五代c、融合七代b中出現(xiàn)了28號新蛋白，

66、在融合一代c、融合五代a、融合七代b、融合七代c中出現(xiàn)了31號新蛋白，在融合一代a、融合一代c、融合三代a、融合五代a、融合七代b、融合七代c中出現(xiàn)了39號新蛋白，在融合三代a、融合五代a、融合七代a中出現(xiàn)了40號新蛋白，在融合五代a中出現(xiàn)了41號新蛋白，在融合一代a、融合三代a、融合三代c、融合五代a中出現(xiàn)了48號新蛋白，在融合三代a、融合三代c、融合五代a、融合七代a、融合七代b、融合七代c中出現(xiàn)了54號新蛋白，在融合一代b、融合三

67、代a、融合三代b、融合五代c、融合七代b中出現(xiàn)了59號新蛋白。而兩親本共同擁有的1號蛋白出現(xiàn)在融合三代a、融合五代a、融合五代b、融合七代b、融合七代c中，6號蛋白出現(xiàn)在融合一代b、融合三代a、融合五代a、融合五代b、融合五代c、融合七代a、融合七代b中，9號蛋白出現(xiàn)在融合一代a、融合一代b、融合一代c、融合五代b、融合五代c、融合七代b</p><p>　　在后代之間的比較中，融合體中基本條帶都比較穩(wěn)定，一些原

68、本含有的蛋白在傳代過程中消失了，在這過程中也產(chǎn)生了一些新蛋白。</p><p>　　由此我們認為根霉和米曲霉的融合過程是較易實現(xiàn)的，但與親本的差異也很大。親本中的蛋白質(zhì)一部分在后代融合體已經(jīng)不存在。后代間有著少量的變異情況，可能需要更進一步的傳代培養(yǎng)以得到更穩(wěn)定的后代。而且我們不難發(fā)現(xiàn)在根霉中含有的蛋白質(zhì)條帶，在融合體中分布率與米曲霉相差不大，這說明根霉的遺傳穩(wěn)定性在后代融合體中與米曲霉相近。</p>

69、<p>　　3.6 列相似性分析</p><p>　　3.6.1 相似性圖表</p><p>　　圖42 列相似性圖表</p><p>　　注：圖中的樣品為：1為根霉、2為米曲霉、3為融合一代a、4為融合一代b、5為融合一代c、6為融合三代a、10為融合三代b、10為融合三代c、12為融合五代a、13為融合五代b、14為融合五代c、15為融合七代a、

70、16為融合七代b、17為融合七代c</p><p>　　從圖中我們可以看到電泳圖譜中各列的條帶在數(shù)量以及電泳遷移距離上的區(qū)別。正如上述表格數(shù)據(jù)以及圖片分析，我們電泳得到了63種不同的蛋白質(zhì)條帶，兩個親本個體中的蛋白組的組成和含量與融合體的蛋白組組成和含量都存在很大的差異。兩親本的相似度僅為22.6%，而在后代融合體中相似度有所提高，說明融合得到了新的菌株。分析結(jié)果我們可以看出來每個條帶中蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量存在很大

71、差異。</p><p>　　3.6.2 親本及其后代的聚類分析</p><p>　　根據(jù)帶分布報告，此圖反映的是各列（菌體）之間的差異性。</p><p>　　圖43 系統(tǒng)聚類圖</p><p>　　從圖43中可分析，根霉與米曲霉相差很大，屬不同品種。融合后代一部分趨向于與根霉，一部分趨向與米曲霉，但彼此間差異比較大。在趨向于與根霉一個種中

72、比較明顯的是融合七代c，可以認為是同一個品種，在趨向于與米曲霉一個種中比較明顯的是融合三代c，融合三代a，融合五代a，我們可以認為是同一品種。融合一代與融合三代親緣關(guān)系比較接近，說明遺傳較穩(wěn)定。融合五代與融合七代親緣關(guān)系較遠，在傳代過程中有蛋白質(zhì)丟失，說明其遺傳不穩(wěn)定。融合五代a、融合五代c、融合一代c與親本存在差異性。在后代中一代與五代存在明顯的差異性。</p><p><b>　　4 小結(jié)</

73、b></p><p>　　本次試驗采用親本根霉與米曲霉誘變選育高酶活融合進行傳代培養(yǎng)。分析得到的融合后代，我認為后代與親本之間存在一定的差異。從酶活的結(jié)果中可以看出后代的蛋白酶活比親本的高且傳代越多酶活越高，淀粉酶與親本相似。我們認為兩親本融合影響其酶活在后代中的表達，且傳代會繼續(xù)影響酶活的表達。融合后代在產(chǎn)生新的蛋白條帶的同時也失去了一些在親本中存在的蛋白質(zhì)，原因是因為消失的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性差，不能在后代中表

74、達，而一些在后代和親本都存在的蛋白質(zhì)，說明在后代中存在的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好。</p><p>　　經(jīng)過本次實驗，發(fā)現(xiàn)實驗中要改進的地方為以下幾點：</p><p>　　（1）接種染菌問題：剛開始接種由于沒注意細節(jié)問題，消毒不夠充分導(dǎo)致經(jīng)常染菌。</p><p>　?。?）提取蛋白質(zhì)問題：本次實驗首次提取蛋白的時是先將菌毛進行干燥處理，這樣提取的蛋白量不多充分，最后取消了

75、干燥處理之后蛋白的提取量增多，所以當(dāng)實驗結(jié)果不理想時應(yīng)該換一種方法處理。多種方法對比，取最好的。</p><p>　　（3）制作膠板問題：由于大膠板沒有制膠槽，所以要自己有瓊脂糖溶液進行封膠，由于技術(shù)不夠封膠一直封不好，總是漏水，經(jīng)多次嘗試和改進后終于總結(jié)出了一個適合我們的封膠方法，才得以順利的電泳。</p><p>　?。?）條帶拖尾現(xiàn)象：電泳過程中經(jīng)常出現(xiàn)條帶拖尾現(xiàn)在，可能是由于膠板之

76、間的密封性不夠好，跑電泳時電壓過高。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 梁平彥,劉宏迪.青霉和產(chǎn)黃青霉的種間體細胞雜交[J].微生物學(xué)報,1982,22(3):248-256.</p><p>　　[2] Hopwood DA,Wright H M.Genetic recombination throug

77、h protoplast fusion in Streptomyces [J].JGen Microbiol,1979,111(1):137-143.</p><p>　　[3] 霍乃蕊,韓克光,細胞融合技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用[J].激光生物學(xué)報,2006,15(2):209-213.</p><p>　　[4] 朱河水,劉記強,楊國宇等.原生質(zhì)體融合技術(shù)的應(yīng)用[J] .安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2007,3

78、5(5):1312-1326.</p><p>　　[5] 陳義華.乳酸的發(fā)酵研究[J].微生物學(xué)通報,1989,3:148-150.</p><p>　　[6] 林祖申.關(guān)于釀造產(chǎn)品米曲霉菌株的誘變育種[J].上海調(diào)味品,1982,03(002):11-13.</p><p>　　[7] 郭勇.現(xiàn)代生化技術(shù)[M].廣州華南理工大學(xué)出版社,2006,1(7):77-

79、78.</p><p>　　[8] 王國良.對小猿葉甲高毒力煙曲霉菌株的選育技術(shù)[J].中國生物防治,2008,24(2):182-185.</p><p>　　[9] 王燕.熱-紫外滅活雙親原生質(zhì)體融合選育米曲霉新菌株的研究[J].中國釀造,2008,19:42-44.</p><p>　　[10] 胡承香,張玉純,李磊.SDS一聚丙烯酞胺凝膠電泳技術(shù)的改良及其應(yīng)