基于殼聚糖和hrp的新型葡萄糖生物傳感器的研究[畢業(yè)設計]

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　基于殼聚糖和HRP的新型葡萄糖生物傳感器的研究</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 環(huán)境工程 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　摘要: 殼聚糖生物相容性好，對酶有很

3、好的親和力，并能有效防止酶的滲漏，因此本論文中將殼聚糖和葡萄糖氧化酶固定在電極表面。葡萄糖氧化酶催化溶液中的葡萄糖發(fā)生氧化反應生成H2O2，溶液中的辣根過氧化酶(HRP)催化生成的H2O2分解成羥基自由基，羥基自由基不可逆地氧化非電活性的Amplex UltraRed生成水和具有電活性的resorufin（7-羥基-3H-吩噁-3-嗪酮）。Resorufin在大約-0.1V（vs.SCE）發(fā)生一個可逆的2電子還原的化學反應生成dihyd

4、roresorufin而被檢測，從而達到間接地檢測葡萄糖的目的。將Amplex UltraRed用于基于酶的生物傳感器的電化學研究，致力于制備響應時間更快，靈敏度更高的葡萄糖傳感器。我們使用生物相容性好，對酶有很好的親和力，并能有效防止酶的滲漏的殼聚糖將葡萄糖氧化酶固定在電極表面從而制得一種新型的葡萄糖傳感器，并對此電極的電化學性質進行了研究。該修飾電極對葡萄糖具有良好的電催化氧化作用,氧化峰電流的大小與葡萄糖的濃度呈良好的線性關系,線

5、性范圍是0.8μmol/L～324μmol/L,最低檢測限是0.4μmol/L(S/</p><p>　　關鍵詞: 殼聚糖 辣根過氧化酶(HRP) 葡萄糖傳感器</p><p>　　Abstract: Novel Electrochemical Assay for Glucose Biosensor Based. Amplex UltraRed and Horseradish Pero

6、xidase. A novel method for low-level, low-potential electrochemical detection of glucose using a chemically activated redox mediator has been developed. This method is unique in that it utilizes a fluorogenic peroxide su

7、bstrate, Amplex UltraRed (N-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine),Upon peroxidase catalyzed turnover of H2O2 with Amplex UltraRed,the fluorescent and electroactive product resorufin </p><p>　　Keywords: Amplex Ult

8、raRed HRP glucose biosensor</p><p><b>　　目 錄</b></p><p>　　摘要…………………………………………………………………………………………………… Ⅰ </p><p>　　Abstract……………………………………………………………………………………………… Ⅱ</

9、p><p><b>　　1 緒論1</b></p><p><b>　　2 實驗部分3</b></p><p><b>　　2.1試劑3</b></p><p><b>　　2.2儀器3</b></p><p>　　2.3葡

10、萄糖傳感器的制備3</p><p>　　3 結果與分析4</p><p>　　3.1 Amplex UltraRed和HRP對H2O2的電催化性質研究4</p><p>　　3.2 Amplex UltraRed 和HRP催化H2O2的催化機理探討5</p><p>　　3.3 新型GOD/CHIT葡萄糖傳感器對葡萄糖的檢測7&l

11、t;/p><p>　　3.4新型GOD/CHIT葡萄糖傳感器的選擇性7</p><p>　　3.5新型葡萄糖傳感器對葡萄糖檢測的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性8</p><p><b>　　4 結論10</b></p><p><b>　　參考文獻11</b></p><p><

12、b>　　1 緒論</b></p><p>　　葡萄糖是生命活動中不可缺少的一種物質，它在人體內能直接參與新陳代謝過程，是機體所需能量的主要來源，它在體內被氧化成二氧化碳和水并同時供給熱量，或以糖原形式貯存。它能補充體內水分和糖分,具有補充體液、供給能量、補充血糖、強心利尿、解毒等作用，還能促進肝臟的解毒功能，對肝臟有保護作用。糖尿病最常見的癥狀是糖代謝的混亂，它會導致血糖濃度的升高，如果得不到

13、控制，就會引起生命危險。血糖只是指血液中的葡萄糖而言，不包括果糖、半乳糖等單糖。正常人血糖處于動態(tài)平衡狀態(tài)，也就是說血糖只是在一個狹窄的范圍內變動。多數(shù)人空腹血糖多在3.3～6.1mmol／L之內，餐后半小時及1小時血糖不超過11.11mmol／L范圍。血糖的來源包括食物消化、吸收、肝內儲存的糖原分解、從脂肪和蛋白質糖異生等。血糖的去路，包括氧化轉為能量;轉化為糖原儲于肝臟、腎臟和肌肉中；轉變?yōu)橹竞偷鞍踪|等其他營養(yǎng)成分加以儲存。人體調

14、節(jié)血糖的重要系統(tǒng)和器官包括內分泌神經系統(tǒng)。肝臟能通過儲存和釋放葡萄糖來調節(jié)血糖，神經系統(tǒng)可通過對糖類的攝取、消化、利用和儲存等直接作用來調節(jié)血糖；也能通過內分泌系統(tǒng)間接影響血糖；而內分泌系統(tǒng)則可分泌多種激素調節(jié)</p><p>　　1962 年，Clark 和 Lyons[1]首先提出酶與電極結合的設想，他們將酶溶液夾在兩層透析膜之間形成一層薄的液層，再緊貼在pH 電極、氧電極和電導電極上，用于監(jiān)測液層中的反應：

15、1967年Updike和Hicks[2]采用當時的最新方法，將葡萄糖氧化酶固定在氧電極表面，研制出世界上第一支葡萄糖傳感器，從此，能簡便、快速、準確地測定葡萄糖濃度的葡萄糖氧化酶(GOD)傳感器的研究一直都是人們關注的熱點。近年來，葡萄糖傳感器的研究領域取得了較突出的進展．朱邦尚[]3等選用B-環(huán)糊精與戊二醛縮合成的B-環(huán)糊精聚合物（B-CDP）為主體，電媒介體，1’2-二甲基二茂鐵為客體，形成穩(wěn)定的主客體包絡物。用牛血清白蛋白/戊二醛

16、交聯(lián)法，把葡萄糖氧化酶和主客體包絡物固定到電極上，傳感器的穩(wěn)定性和使用壽命顯著提高。采用鉑絲電極經鉑化處理制備的雜聚吡咯/GOD膜，葡萄糖酶電極穩(wěn)定性良好，間斷測定 3 個月，靈敏度仍達原來的70%左右。張國林[4]等采用乙基纖維素和乙炔黑導電復合材料制備固定化葡萄糖酶電極。結果表明：用環(huán)己烷洗去石蠟的導電復合材料/葡萄糖氧化酶生物傳感器具有粒狀結構，有利于酶催化反應。利用</p><p>　　使用氧化還原媒介體

17、需要使用指示劑，為避免指示劑可能具有氧化還原性質而產生的爭議,我們使用了本身沒有電活性的媒介體（Amplex UltraRed）,它能被酶與底物作用產生的H2O2氧化產生具有電活性的物質（resorufin，7-羥基-3H-吩噁-3-嗪酮）[9]。Resorufin在大約-0.1V（vs.Ag/AgCl）[10]發(fā)生一個可逆的2電子還原的化學反應生成dihydroresorufin[11]而被檢測。在這里，H2O2氧化Amplex Ul

18、traRed的反應計量比是1:1，由于生成resorufin，H2O2可以在更低的還原電位下被檢測。此傳感器有效避免了其他具有更高氧化電位的電活性物質的干擾，提高了電極的壽命，降低了溶液由于pH變化而引起的水在高過電位下的發(fā)生的氧化還原反應。</p><p>　　本文中我們試圖將Amplex UltraRed用于基于酶的生物傳感器的電化學研究，致力于制備響應時間更快，靈敏度更高的葡萄糖傳感器。我們使用生物相容性好

19、，對酶有很好的親和力，并能有效防止酶的滲漏的殼聚糖將葡萄糖氧化酶固定在電極表面從而制得一種新型的葡萄糖傳感器，并對此電極的電化學性質進行了研究。由于Amplex UltraRed和HRP的引入，使得該傳感器具有較低的工作電位，避免了大多數(shù)還原性物質的干擾。實驗結果表明，該傳感器具有較高的靈敏度及良好的抗干擾能力，并且具有制備簡單，穩(wěn)定性好，響應時間短等特點。</p><p><b>　　2 實驗部分&

20、lt;/b></p><p><b>　　2.1試劑</b></p><p>　　Amplex UltraRed(Invitrogen,A36006,5×1mg); 辣根過氧化酶（HRP,上海麗珠東風生物技術有限公司）;過氧化氫（30%H2O2,國藥集團化學試劑有限公司,AR）;葡萄糖氧化酶（GOD,EC1.1.3.4,133600U/g, type

21、Ⅶ-S from Aspergillus niger, Sigma）;葡萄糖（C6H12O6?H2O）；二甲亞砜（上海東懿化學試劑公司）；殼聚糖（CHIT，10mg/mL，用1％醋酸配成）；多巴胺(DA, Sigma);抗壞血酸（AA, Sigma）；300U/mL HRP溶于0.1M K2HPO4/0.05M檸檬酸的緩沖（McIlvaine buffer，pH 5.0）儲備液，實驗時稀釋至0.2 U/mL; 其余試劑均為分析純，實驗用

22、水為二次蒸餾水。</p><p><b>　　2.2儀器</b></p><p>　　電化學實驗所用儀器為CHI832B電化學分析儀（CHI公司，美國），論文中所有的電化學實驗均采用三電極體系：以玻碳電極（直徑3mm，日本東海株式會社）作電極，飽和甘汞電極（SCE，江蘇電分析儀器廠）為參比電極，鉑電極為對電極。</p><p>　　2.3葡萄糖

23、傳感器的制備</p><p>　　將玻碳電極分別用金相砂紙，氧化鋁粉末(0.05μm)在麂皮上打磨拋光成鏡面后，用二次去離子水沖洗，然后在硝酸(1:1體積比)，氫氧化鈉溶液(1.0mol/L)，丙酮及去離子水中各超聲洗滌5min，晾干待用。</p><p>　　稱取0.1g殼聚糖置于小燒杯中，加入1％的醋酸溶液10mL并攪拌2h，得到粘稠的10mg/mL殼聚糖溶液， 取此溶液和葡萄糖氧化酶

24、溶液等體積混合，取2μL滴加到玻碳電極上，自然晾干，待用。</p><p><b>　　3 結果與分析</b></p><p>　　3.1 Amplex UltraRed和HRP對H2O2的電催化性質研究</p><p>　　用循環(huán)伏安法考察了Amplex UltraRed和HRP對雙氧水的催化性質。圖1是玻碳電極在含0.2U/mL HRP

25、的pH 5.0 McIlvaine buffer中在未加入（a,b）和加入(c,d)Amplex UltraRed時對1.0×10-3mol/L H2O2的循環(huán)伏安圖。在未加入Amplex UltraRed時，在-0.4V~0.2V電位區(qū)間內HRP對H2O2并沒有催化效應（圖1c）。而當溶液中有Amplex UltraRed存在時（圖1d），當掃描速率是100mv/s時，resorufin-dihydroresorufin電對

26、的陽極電位Ep,a和陰極電位Ep,c分別是-0.117V和-0.174V，表觀電動勢E0是-0.146V，E0=1/2(Ep,a+ Ep,c)，峰峰電位差Ep是57mV，這說明確實是溶液中的Amplex UltraRed催化H2O2的。</p><p>　　我們還用i-t法考察了Amplex UltraRed和HRP對H2O2的催化還原。圖2是玻碳電極在含0.2 U/mL HRP 和 50 μmol/L Ampl

27、ex UltraRed 的McIlvaine buffer緩沖溶液(pH 5.0)中對H2O2的i-t曲線，工作電位為-0.1V。在2.0×10-7mol/L～3.0×10-5mol/L范圍內還原峰電流與H2O2濃度呈現(xiàn)出良好的線性關系，相關系數(shù)是0.9964，檢測下限為1.0×10-7mol/L（S/N＝3）。</p><p>　　3.2 Amplex UltraRed 和HRP催

28、化H2O2的催化機理探討</p><p>　　圖示1為通過Amplex UltraRed檢測氧化酶產生的H2O2的信號轉換方式：葡萄糖氧化酶催化溶液中的葡萄糖發(fā)生氧化反應生成H2O2，溶液中的辣根過氧化酶(HRP)催化生成的H2O2分解成羥基自由基，羥基自由基不可逆地氧化Amplex UltraRed生成水和具有電活性的resorufin。Resorufin在大約-0.1V（vs.SCE）發(fā)生一個可逆的2電子還原

29、的化學反應生成dihydroresorufin而被檢測，從而達到間接地檢測葡萄糖的目的。</p><p>　　其中Amplex UltraRed 在HRP催化下發(fā)生如下的反應：</p><p>　　3.3 新型GOD/CHIT葡萄糖傳感器對葡萄糖的檢測</p><p>　　圖3是在-0.1V工作電位，用i-t曲線來測定GOD/CHIT修飾電極對葡萄糖的響應電流。實驗

30、結果表明：制得的傳感器對葡萄糖具有較快的響應時間，在10s內達到穩(wěn)態(tài)電流的95%，同時還原峰電流與葡萄糖濃度在8.0×10-7～3.0×10-5mol/L范圍內呈現(xiàn)出良好的線性關系，相關系數(shù)是0.9989，檢測下限為4.0×10-7mol/L（S/N＝3）。</p><p>　　根據lineweaver-burk公式1/Icat=1/Imax+Kmapp/ImaxCglucose可計

31、算米氏常數(shù)(Kmapp)，式中，Icat是加入底物后測得的穩(wěn)態(tài)電流，Cglucose是底物濃度，Imax是加入飽和底物后測得的最大電流[12]。米氏常數(shù)是酶-底物動力學的特征參數(shù)，較低的米氏常數(shù)表明較高的催化能力，這里算得Kmapp為21.78μmol/L，文獻曾報道過PB修飾電極對葡萄糖的Kmapp為200±30μmol/L[13],表明我們所采用的Amplex UltraRed和HRP對葡萄糖具更高的催化活性（Kmapp越

32、小，催化活性越高）。</p><p>　　3.4新型GOD/CHIT葡萄糖傳感器的選擇性</p><p>　　在實際樣品中，許多共存物質可能會干擾傳感器的響應，比如：抗壞血酸（AA），多巴胺(DA)等。由于我們是在-0.1V的工作電位下，這些干擾物質很難被還原，從而可以大大降低干擾。如圖4所示，以GOD/CHIT修飾電極為工作電極，在含0.2 U /mL HRP 和 50 μmmol /L

33、 Amplex UltraRed 的McIlvaine buffer緩沖溶液（pH 5.0）中依次加入不同濃度的干擾物質（2×10-6mol/L 葡萄糖，1×10-6mol/L DA, 2.0×10-4mol/L AA及5μL緩沖溶液）來考察傳感器的選擇性。從圖4可以看出，當加入葡萄糖之后，響應電流迅速增加，并在短時間內達到平衡。而加入DA, AA及緩沖溶液后響應電流值幾乎沒有發(fā)生變化，這說明GOD/CHI

34、T修飾電極對葡萄糖的檢測具有良好的選擇性。</p><p>　　3.5新型葡萄糖傳感器對葡萄糖檢測的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性</p><p>　　將GOD/CHIT修飾電極放在含0.2 U/mL HRP 和 50 μmol/L Amplex UltraRed 的McIlvaine buffer緩沖溶液中重復進樣6次，如圖5所示，所得響應電流的相對標準偏差為4.85%。相同條件下制備4根電極對1

35、15;10-6mol/L葡萄糖的響應的相對標準偏差是3.85%。這說明用該方法制得的修飾電極的性質穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好。</p><p><b>　　4 結論</b></p><p>　　本文使用生物兼容性好的殼聚糖固定葡萄糖氧化酶于玻碳電極上，使用了本身無電活性的染料媒介體（Amplex UltraRed），該媒介體可以被葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖時產生的H2O2催化

36、而生成具有電化學活性的物質（resorufin）,從而間接地檢測葡萄糖。由于是在-0.1V的工作電位下，避免了大多數(shù)還原性物質的干擾，顯著提高了該電極的選擇性，同時該電極具有響應速度快、穩(wěn)定性好、制備簡單等優(yōu)點。此方法為其他以H2O2為產物的酶電極的構筑提供了一個參考，預計在生命科學中得到進一步的應用。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　

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