烏賊墨汁多糖的提取工藝研究【開題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報(bào)告</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程</b></p><p>　　烏賊墨汁多糖的提取工藝研究</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><p&

2、gt;　　烏賊具有高營養(yǎng)、生活史較短（通常一年）、生長快和分布廣等特點(diǎn)，是一類很有發(fā)展前景的海水養(yǎng)殖種類，也是海洋中最大、最具潛在價(jià)值的蛋白質(zhì)資源。隨著國內(nèi)水產(chǎn)加工業(yè)的發(fā)展，生產(chǎn)過程產(chǎn)生的下腳料逐年增多，造成環(huán)境污染、資源浪費(fèi)。烏賊墨常作為下腳料被丟棄，造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。烏賊墨的主要成分為蛋白質(zhì)、脂肪、糖、黑色素和多種微量元素。烏賊墨由于其獨(dú)特的生物活性，成為研究較熱的一項(xiàng)內(nèi)容。多糖又稱為多聚糖, 是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，它

3、存在于生物體一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的各種活動(dòng)，有多種多樣的生物學(xué)功能。多糖是由10個(gè)以上單糖通過糖苷鍵連接而成的聚糖。多糖類物質(zhì)包括：糖原，甲殼素，肝素，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸角質(zhì)素，酸性粘多糖或糖胺聚糖。其中肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素都屬糖胺聚糖海洋動(dòng)物作為動(dòng)物多糖的重要來源之一，具有多種特殊的生物學(xué)功能。</p><p>　　目前，研究烏賊墨汁多糖的相對(duì)較少。我國烏賊產(chǎn)量豐富，但

4、是在烏賊的加工過程中,烏賊墨常被丟棄,造成相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失和環(huán)境污染。文獻(xiàn)報(bào)道中對(duì)烏賊墨汁多糖的研究較少，為提高烏賊的利用價(jià)值,本實(shí)驗(yàn)對(duì)烏賊墨汁多糖進(jìn)行部分研究。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p><b>　　基本內(nèi)容：</b></p><p>　　料水比對(duì)墨汁多糖的提取工藝的影響</p>

5、<p>　　加酶量對(duì)墨汁多糖的提取工藝的影響</p><p>　　提取時(shí)間對(duì)墨汁多糖的提取工藝的影響</p><p>　　PH對(duì)墨汁多糖的提取工藝的影響</p><p>　　溫度墨汁多糖的提取工藝的影響</p><p><b>　　擬解決的主要問題：</b></p><p>　　1．確

6、定料水比、加酶量、提取時(shí)間、PH、溫度對(duì)烏賊墨汁多糖提取的影響</p><p>　　2．最佳提取工藝的確定 </p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2010.10—2010.12</p><p>　　查閱相關(guān)文獻(xiàn)和資料，熟悉實(shí)驗(yàn)基本操作&l

7、t;/p><p>　　2011.12—2011.1</p><p>　　實(shí)驗(yàn)探索，前期準(zhǔn)備工作</p><p>　　2011.2—2010.5</p><p><b>　　進(jìn)行試驗(yàn)，撰寫論文</b></p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p>&

8、lt;p>　　[1] 駱傳環(huán),黃榮清,劉曙晨.海星多糖的分子量測(cè)定[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊, 2002,26(2).</p><p>　　[2] 殷涌光,韓玉珠,丁宏偉.動(dòng)物多糖的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2006,27(3):256-262.</p><p>　　[3] 劉天龍,許劍琴.多糖現(xiàn)代研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)雜志,2004,40(3):24-26.</p&g

9、t;<p>　　[4] 馬寶瑕,陳新,鄧軍娥.中藥多糖研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2003,23(6):360-362.</p><p>　　[5] 萬淑瑩,何光星,徐嘉紅.蠶蛹多糖的分離和分析[J].中成藥,1992,14(3):35.</p><p>　　[6] 劉興杰,劉傳琳,任虹等.?？人姆N動(dòng)物粘多糖堿提取的比較研究[J].煙臺(tái)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,14(4):

10、264-268.</p><p>　　[7] 陳菊嫡,樊繪曾,邢蕊凝等.花刺參酸性粘多糖的分離研究[J].中國海洋藥物,1994,1:24.</p><p>　　[8] 張紅巖,呂琳.鹿茸酸性多糖的含量測(cè)定研究[J].中成藥,1988,(10):34.</p><p>　　[9] 唐孝禮,邱鵬新,黎明濤等.黑海參酸性粘多糖的分離純化[J].中藥材,1999,22(5

11、):223.</p><p>　　[10] 鄧永智,李文權(quán),袁東星. 海水小球藻中多糖的提取及其單糖組成的氣相色譜－質(zhì)譜分析[J].分析化學(xué),2006,34(12):1697－1701.</p><p>　　[11] 鐘丹,張建新,張世恒.超聲波提取牛蒡菊糖[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,17(2):297－300．</p><p>　　[12] 佘志剛,胡谷平,吳

12、耀文等.鮑魚多糖Hal-A的甲醇解研究[J].有機(jī)化學(xué),2002,22(5):367.</p><p>　　[13] 吳梧桐,高向東.豬胎盤脂多糖的分離純化及其對(duì)脾淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)作用[J].生物化學(xué)雜志,1990,6 (2):111.</p><p>　　[14] 吳紅棉,雷曉凌,洪鵬志等.珠母貝糖胺聚糖的純化及其化學(xué)性質(zhì)[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2000,24(6):570.</p>

13、<p>　　[15] 張彥民,李寶才,朱利平等.多糖化學(xué)及其生物活性研究進(jìn)展[J].昆明理工大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版),2003, 28(3):140-149.</p><p>　　[16] 柴向華,佘綱哲,吳克剛等.鯊魚軟骨多糖的提取工藝研究[J].中國生化藥物雜志,1999,20(1):38.</p><p>　　[17] Lignot B,Labhogue V,Bourseau

14、 P.Enzymatic extraction of chondroitin sulfate from skate eartilage and concentrationdesalting by ultrafiltration [J].J biotechnol,2003,103(3):281-284</p><p>　　[18] 鈕明洋,姚文兵,姚金鳳等.超濾法在海洋真菌多糖分離純化工藝中的應(yīng)用[J].中國生化藥

15、物雜志,2004,25(3):61-62.</p><p>　　[19] 陳浩凡,潘仕榮,胡喻等.動(dòng)物多糖的分離純化方法[J].現(xiàn)代食品與藥品雜志,2007,17(13):9-12.</p><p>　　[20] 范秀萍,吳紅棉,雷曉凌等.珠母貝氨基多糖的分離純化及其抗腫瘤活性的初步研究[J].中國海洋藥物.2005,24(2):32-36.</p><p>　　[

16、21] 欽傳光,黃開勛,徐輝碧.泥鰍中的生物活性分子及其藥理作用中國生化藥物雜志,2002,23(1):47-48.</p><p>　　[22] 聶凌鴻,寧正祥.廣東淮山水溶性多糖的分離純化及體外抗氧化活性的研究[J].食品科學(xué),2003,24(11):129-133.</p><p>　　[23] 劉榮,孫芳,陳秀麗等.松仁多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步分析[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2008,28(

17、4):115-117.</p><p>　　[24] 念保義,陳銘,王錚敏.超濾膜分離香菇多糖的研究[J].化學(xué)工業(yè)與工程技術(shù),2003,24(4):27-30.</p><p>　　[25] 來魯華,楊顯婷.寡糖的構(gòu)象分析[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1995,22(4):290-294.</p><p>　　[26] Reinhold V N,Reinhol

18、d B B,Costello C E. Carbohydrate molecular weigh profiling：sequence,linkage,and branching data:Es-CID[J].Anal Chem,1995,67(1):1772-1784.</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　食品

19、科學(xué)與工程</b></p><p>　　烏賊墨汁多糖的提取工藝研究</p><p>　　摘要：本文對(duì)動(dòng)物多糖的提取，分離純化進(jìn)行了簡單的描述以及簡單介紹了多糖分級(jí)純化方法——超濾法和柱層析法，同時(shí)對(duì)多糖的分析鑒定方面做了一定描述。</p><p>　　關(guān)鍵詞：多糖；提?。环蛛x純化；分析鑒定 </p><p>　　多糖又稱為多聚糖

20、，是一大類天然產(chǎn)物，由10個(gè)以上單糖通過糖苷鍵連接而成的聚糖，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，廣泛存在于植物、微生物、動(dòng)物[1]等有機(jī)體中。多糖類物質(zhì)包括：糖原(glycogen)，甲殼素(chitin)，肝素(heparin)，硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)，透明質(zhì)酸(hyaluronic acid)，硫酸角質(zhì)素(keratan sulfate)，酸性粘多糖(acid mucopolysaccharide)或糖胺聚

21、糖(glycosam-inog lycan)。其中肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素都屬糖胺聚糖[2]。由于多糖在臨床上、食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)及石油工業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[3]，使多糖生物資源的開發(fā)利用和研究日益活躍，成為天然藥物、生物化學(xué)、生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)，到目前為止，已有300 多種多糖類化合物從天然產(chǎn)物中被分離出來[4]。本文對(duì)多糖的提取、分離和純化、分析量和純度等和方面的研究進(jìn)展進(jìn)行概括和綜述。</p><p

22、><b>　　1 多糖的提取</b></p><p>　　根據(jù)多糖的存在形式及提取部位的不同，在提取之前確定是否需要進(jìn)行預(yù)處理。動(dòng)物多糖的提液，通常首先要去除表面脂肪，一般將原料經(jīng)粉碎后加入丙酮等脫脂，脫脂后過濾得到的殘?jiān)儆盟魅軇┻M(jìn)行提取。如萬淑瑩等[5]將蠶蛹干粉經(jīng)丙酮脫脂，沸水提取，乙醇沉淀分離制備多糖。多糖的提取目前常用堿解法、熱水浸提法、酶解法或堿解與酶解相結(jié)合的方法、微波

23、輔助提取法、超聲波輔助提取法。如劉興杰等[6]堿提取法從綠疣海葵等4種海洋無脊椎動(dòng)物中提取酸性粘多糖。陳菊嫡等[7]用堿解法提取分離花刺參酸性粘多糖；張紅巖等[8]用木瓜酶消化方法提取分離鹿茸中酸性多糖C. Maes等[9]用堿性過氧化氫提取小麥麩皮中的非淀粉多糖。唐孝禮等[10]用堿解與酶解相結(jié)合的方法提取分離黑海參酸性粘多糖。鄧永智[11]等利用微波輔助提取法從海水小球藻中提取多糖。鐘丹等[12]采用超聲波提取牛蒡菊糖。Mysore

24、[13]用熱水浸提法提取高粱中的多糖。得到的多糖提取液大多較粘稠，可進(jìn)行吸濾，也可用離心法將不溶性雜質(zhì)除去，將濾液或上層清液合并(若為堿溶性多糖則需中和)。合并的多糖提取液經(jīng)濃縮后，醇沉，也可加入費(fèi)林氏溶液或硫酸銨或溴化十六烷基三</p><p><b>　　2 多糖的分離純化</b></p><p>　　提取的粗多糖中常含有色素、多肽、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)及無機(jī)鹽類成分，因

25、此需將其進(jìn)行分離純化。</p><p><b>　　2.1 去除蛋白</b></p><p>　　幾乎所有動(dòng)物多糖都與蛋白質(zhì)相連，因此動(dòng)物多糖的提取首要問題是在多糖不被顯著降解的條件下去除結(jié)合的蛋白質(zhì)。多糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合不是物理或離子結(jié)合，而是共價(jià)結(jié)合。經(jīng)堿提取及蛋白酶水解的組織消化液，是組分及性質(zhì)相近的多糖混合物，它們的多羥基及強(qiáng)電解性使其處于可溶狀態(tài)，除去殘留蛋白

26、質(zhì)和各種小分子將為多糖的進(jìn)一步分級(jí)分離創(chuàng)造條件。除蛋白常用的有Sevage法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法等電點(diǎn)沉淀法等。如佘志剛等[14]用Sevage法除蛋白制備鮑魚多糖，吳梧桐等[15]用三氯乙酸法除蛋白制備豬胎盤脂多糖，吳紅棉等[16]用等電點(diǎn)沉淀法除蛋白制備珠母貝糖胺聚糖。利用各種多糖的溶解度不同及電荷密度的差異進(jìn)行分離，由于各種多糖結(jié)構(gòu)和活性的不均一性和分子量的高分散性，分離得到單一多糖后，還可按其理化性質(zhì)及生物活性進(jìn)一步分離

27、[17]。</p><p><b>　　2.2 脫色</b></p><p>　　多糖中常含有一些色素，可以根據(jù)其不同性質(zhì)采取不同的方法進(jìn)行脫色。常用的脫色方法有：離子交換法、氧化法、吸附法(纖維素、硅藻土、活性炭等)等。如柴向華等[18]在制備鯊魚軟骨多糖時(shí)用活性炭、白陶土進(jìn)行脫色。另外，DEAE-纖維素是目前最常用的脫色劑，通過離子交換柱不僅可以達(dá)到脫色的目的，而

28、且還可以分離多糖。</p><p>　　2.3 分級(jí)純化方法</p><p><b>　　2.3.1 超濾法</b></p><p>　　超濾現(xiàn)是一種種重要的分離純化實(shí)驗(yàn)技術(shù)，廣泛用于含有小分子溶質(zhì)的各種生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖、酶、核酸等的濃縮、分離和純化。溶質(zhì)或懸浮物料按大小不同而分離，比膜孔小的物質(zhì)和溶劑一起透過膜，而較大的物質(zhì)則被截留。

29、在操作過程中不會(huì)改變產(chǎn)品的性能和活性，對(duì)不穩(wěn)定產(chǎn)品是安全的，因而對(duì)于動(dòng)物多糖這樣的高分子生物活性物質(zhì)來說是最適合的。Lignot等經(jīng)比較證實(shí)超濾技術(shù)用于濃縮純化硫酸軟骨素的可行性，并證明孔徑為0.1μm 時(shí)超濾膜分離效果最佳。鈕明洋[19]用超濾法代替透析法去除海洋真菌多糖提取液中的單糖等小分子雜質(zhì)，結(jié)果表明超濾法所得產(chǎn)品的得率和多糖含量都高于透析法，更加適合于中試生產(chǎn)使用。由于超濾法處理的液體多數(shù)是含有水溶性生物大分子、有機(jī)膠體、多糖

30、及微生物等。這些物質(zhì)極易勃附和沉積于膜表面上，造成嚴(yán)重的濃差極化和堵塞，這是超濾法最關(guān)鍵的問題，要克服濃差極化，通?？杉哟笠后w流量，加強(qiáng)湍流和加強(qiáng)攪拌。但總的來說，超濾技術(shù)的應(yīng)用有很好的前景，將會(huì)引起更多的重視。</p><p>　　2.3.2 柱層析法</p><p>　　層析技術(shù)是常用的分離純化方法。它是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)

31、等的差異，在物質(zhì)經(jīng)過兩相中，不斷地進(jìn)行交換、分配等過程，而這過程會(huì)產(chǎn)生不斷的吸附一解吸一吸附一解吸作用，造成混合物中各組分距離不等的遷移，從而達(dá)到分離的目的。柱層析又稱柱色譜，是通過色譜柱的分離作用，而達(dá)到純化。動(dòng)物多糖不能滲人到交聯(lián)的結(jié)構(gòu)中，因此不能在一般的樹脂上被分離。而纖維素之所以具有分離、純化高分子量化合物的能力，是因?yàn)樗哂兴缮⒌挠H水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較大的表面積，大分子可以自由通過，因此對(duì)動(dòng)物多糖來說，纖維素的交換能力比離子交換

32、樹脂要大，同時(shí)纖維素來源于生物材料，洗脫條件溫和，回收率高[20]。范秀萍[21]用纖維素柱純化珠母貝氨基多糖，得到高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氨基己糖。凝膠柱層析是另一類應(yīng)用廣泛的方法，它有交聯(lián)葡聚糖凝膠系列柱、瓊脂糖凝膠系列柱、系列柱等。凝膠起分子篩作用，分離的依據(jù)是分子的形狀和分子的大小不同。欽傳光[22]從泥鰍赫液中分離提取到中性的粗多糖，粗多糖經(jīng)凝膠柱過濾，分離得到純化的高聚糖和寡糖。</p><p><b>

33、;　　3 多糖的分析鑒定</b></p><p><b>　　3.1 純度鑒定</b></p><p>　　多糖是高分子化合物，其純品微觀上是不均一的，通常所說的多糖純品實(shí)質(zhì)上是一定分子量范圍的均一組分。多糖純度鑒定的常用方法：超離心、高壓電泳、凝膠層析、HLPC法等。 現(xiàn)在應(yīng)用較多的是HLPC法，旋光度測(cè)定[23]也是純度測(cè)定的一種方法。</p&g

34、t;<p>　　3.2 分子量的測(cè)定</p><p>　　多糖分子量的測(cè)定是研究多糖性質(zhì)的一項(xiàng)重要工作。常用方法：滲透壓法、蒸氣壓滲透劑法、端基法、粘度法、光散射法、凝膠色譜法、超過率法、沉淀法、凝膠電泳法、HPLC法、超離心分析法、分子篩色譜法、GPC法[24]、MALDI－TOF－MS法。</p><p>　　3.3 多糖結(jié)構(gòu)分析</p><p>

35、　　多糖的結(jié)構(gòu)分析手段很多，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的分析是揭示其生物活性、構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)。多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)含義比蛋白質(zhì)豐富得多。要解決一種多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)就必須解決多糖基的組成、糖基的排列順序、相鄰糖基的連接方式、異頭異構(gòu)型以及糖鏈有無分支、分支的位置與長短等。如成分復(fù)雜，也可折斷成幾種片段各自分析，然后湊成一個(gè)整個(gè)化合物。多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析常用化學(xué)法和儀器分析法。如用核磁共振[25]分析羥基被取代情況。多糖序列分析即一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定常用到紅外光譜核磁共振

36、、工具酶應(yīng)用免疫學(xué)方法等[2]。目前研究多糖的二級(jí)結(jié)構(gòu)常用的手段是NMR技術(shù)，如2D－NMR，13C譜，通用的方法是將現(xiàn)代NMR技術(shù)與理論計(jì)算相結(jié)合通過一定的理論計(jì)算篩選構(gòu)象，主要的理論計(jì)算方法有從頭計(jì)算、豐度經(jīng)驗(yàn)計(jì)算及經(jīng)驗(yàn)力場計(jì)算[26]。圓二色譜法（CD）也可用于糖的構(gòu)象分析，張麗萍等應(yīng)用CD譜測(cè)定了金頂側(cè)耳多鍺的水溶液構(gòu)象。近年來，以精確三維結(jié)構(gòu)知識(shí)為基礎(chǔ)揭示重要生命活動(dòng)的規(guī)律已達(dá)到前所未有的深度和廣度，多糖作為一類重要的生物活性

37、大分子其結(jié)構(gòu)的研究勢(shì)必推動(dòng)對(duì)多糖的認(rèn)識(shí)向深層次發(fā)展。</p><p><b>　　3 前景</b></p><p>　　隨著分子生物學(xué)和分析新技術(shù)的高速發(fā)展，特別是許多技術(shù)的聯(lián)用，分析手段變得更加快速、靈敏和高效，從而使得多糖的分離和結(jié)構(gòu)測(cè)定方法也取得了快速的發(fā)展。近年來的工作取得了較大的進(jìn)展，愈來愈多的多糖被發(fā)現(xiàn)。并證實(shí)它們具有復(fù)雜、廣泛的生物活性和功能。隨著對(duì)多糖

38、生物活性的深入研究，多糖的生物活性機(jī)理，功效因子會(huì)更加明確，它的應(yīng)用領(lǐng)域也將會(huì)更加拓寬。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 駱傳環(huán),黃榮清,劉曙晨.海星多糖的分子量測(cè)定[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2002,26(2):5-7.</p><p>　　[2] 殷涌光,韓玉珠,丁宏偉.動(dòng)物多糖的研究進(jìn)展[J].

39、食品科學(xué),2006,27(3):256-262.</p><p>　　[3] 劉天龍,許劍琴.多糖現(xiàn)代研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)雜志,2004,40(3):24-26.</p><p>　　[4] 馬寶瑕,陳新,鄧軍娥.中藥多糖研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2003,23(6):360-362.</p><p>　　[5] 萬淑瑩,何光星,徐嘉紅.蠶蛹多糖的

40、分離和分析[J].中成藥,1992,14(3):35.</p><p>　　[6] 劉興杰,劉傳琳,任虹等.?？人姆N動(dòng)物粘多糖堿提取的比較研究[J].煙臺(tái)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,14(4):264-268.</p><p>　　[7] 陳菊嫡,樊繪曾,邢蕊凝等.花刺參酸性粘多糖的分離研究[J].中國海洋藥物,1994,(1):24.</p><p>　　[8] 張紅巖

41、,呂琳.鹿茸酸性多糖的含量測(cè)定研究[J].中成藥,1988,(10):34.</p><p>　　[9] C.Maes,J.A.Delcour.Alkaline Hydrogen Peroxide Extraction of Wheat Bran Non-starch Polysaccharides [J].Journal of Cereal Science,2001,(34):29-35.</p>

42、<p>　　[10] 唐孝禮,邱鵬新,黎明濤等.黑海參酸性粘多糖的分離純化[J].中藥材,1999,22(5):223.</p><p>　　[11] 鄧永智,李文權(quán),袁東星.海水小球藻中多糖的提取及其單糖組成的氣相色譜－質(zhì)譜分析[J].分析化學(xué),2006,34(12):1697－1701.</p><p>　　[12] 鐘丹,張建新,張世恒.超聲波提取牛蒡菊糖[J].西北農(nóng)業(yè)

43、學(xué)報(bào),2008,17(2):297－300．</p><p>　　[13] Mysore. Water-extracted polysaccharides of selected cereals and infuence of temperature on the extractability of polysaccharides in sorghum [J].Food Chemistry,1999,(64):3

44、45-350.</p><p>　　[14] 佘志剛,胡谷平,吳耀文等.鮑魚多糖Hal-A的甲醇解研究[J].有機(jī)化學(xué),2002,22(5):367.</p><p>　　[15] 吳梧桐,高向東.豬胎盤脂多糖的分離純化及其對(duì)脾淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)作用[J].生物化學(xué)雜志,1990,6 (2):111.</p><p>　　[16] 吳紅棉,雷曉凌,洪鵬志等.珠母貝糖胺聚

45、糖的純化及其化學(xué)性質(zhì)[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2000,24(6):570.</p><p>　　[17] 張彥民,李寶才,朱利平等.多糖化學(xué)及其生物活性研究進(jìn)展[J].昆明理工大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版),2003, 28(3):140-149.</p><p>　　[18] 柴向華,佘綱哲,吳克剛等.鯊魚軟骨多糖的提取工藝研究[J].中國生化藥物雜志,1999,20(1):38.</p>

46、<p>　　[19] 鈕明洋,姚文兵,姚金鳳等.超濾法在海洋真菌多糖分離純化工藝中的應(yīng)用[J].中國生化藥物雜志,2004,25(3):61-62.</p><p>　　[20] 陳浩凡,潘仕榮,胡喻等.動(dòng)物多糖的分離純化方法[J].現(xiàn)代食品與藥品雜志,2007,17(13):9-12.</p><p>　　[21] 范秀萍,吳紅棉,雷曉凌等.珠母貝氨基多糖的分離純化及其抗腫瘤活

47、性的初步研究[J].中國海洋藥物.2005,24(2):32-36.</p><p>　　[22] 欽傳光,黃開勛,徐輝碧.泥鰍中的生物活性分子及其藥理作用中國生化藥物雜志,2002,23(1):47-48.</p><p>　　[23] 聶凌鴻,寧正祥.廣東淮山水溶性多糖的分離純化及體外抗氧化活性的研究[J].食品科學(xué),2003,24(11):129-133.</p>&l

48、t;p>　　[24] 劉榮,孫芳,陳秀麗等.松仁多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步分析[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2008,28(4):115-117.</p><p>　　[25] 念保義,陳銘,王錚敏.超濾膜分離香菇多糖的研究[J].化學(xué)工業(yè)與工程技術(shù),2003,24(4):27-30.</p><p>　　[26] 來魯華,楊顯婷.寡糖的構(gòu)象分析[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1995,22(4)

49、:290-294.</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p>　　烏賊墨汁多糖的提取工藝研究</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　

50、1 引言13</b></p><p>　　2 材料和方法14</p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料14</p><p>　　2.1.1 原料14</p><p>　　2.1.2 試劑14</p><p>　　2.1.3 主要儀器和設(shè)備14</p><p>　　2.1.4

51、其他器材14</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法15</p><p>　　2.2.1 烏賊墨汁多糖的提取15</p><p>　　2.2.2 苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量15</p><p>　　2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備15</p><p>　　2.2.4 多糖含量的測(cè)定16</p><p

52、>　　2.2.5 墨汁多糖提取條件優(yōu)化16</p><p>　　3 結(jié)果和討論16</p><p>　　3.1 加酶量對(duì)墨汁多糖提取的影響16</p><p>　　3.2 料水比對(duì)墨汁多糖提取的影響17</p><p>　　3.3 pH對(duì)墨汁多糖提取的影響18</p><p>　　3.4 提取溫度對(duì)墨汁

53、多糖提取的影響19</p><p>　　3.5 提取時(shí)間對(duì)墨汁多糖提取的影響19</p><p>　　3.6 多糖提取正交實(shí)驗(yàn)分析20</p><p>　　3.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)21</p><p><b>　　4 結(jié)論22</b></p><p><b>　　5 展望22<

54、/b></p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)23</b></p><p>　　附錄錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p>　　摘要:本文以烏賊墨作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，從中提取墨汁多糖。研究了加酶量、料水比、pH、提取溫度、提取時(shí)間五個(gè)因素，通過對(duì)加酶量、料水比、pH、提取溫

55、度、提取時(shí)間進(jìn)行單因素分析確定各個(gè)因素對(duì)多糖提取的影響，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)加酶量、料水比、提取溫度、提取時(shí)間四個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，確定了墨汁多糖的最佳提取方案為料水比為1:25、加酶量為原料量的4.5%、提取溫度為50℃、提取時(shí)間為4h。在此提取條件下，烏賊墨汁多糖的提取率為3.63%。</p><p>　　關(guān)鍵詞:墨汁多糖；提取；正交</p><p>

56、;　　Abstract: This essay extracts ink polysaccharide from sepia which is considered as experimental research object. In this essay, mainly studies following five factors including enzyme concentration、the ratio between ma

57、terial and water、pH、extraction temperature and extraction time and then analyze their influence on the extraction of polysaccharide. According to the single factor experiment results, carry out a orthogonal experiment L9

58、 (34) based on enzyme concentration、the ratio between material </p><p>　　Keywords: Sepia ink polysaccharide; extraction; orthogonal</p><p><b>　　1 引言</b></p><p>　　烏賊本名烏鲗，

59、又稱花枝、墨斗魚或墨魚，屬于軟體動(dòng)物門頭足綱烏賊目烏賊科烏賊屬的一種海洋動(dòng)物，具有較高營養(yǎng)和多種藥用功能。常見種類有：金烏賊、虎斑烏賊、白斑烏賊、擬目烏賊、羅氏烏賊、曼氏無針烏賊等[1]。烏賊肉質(zhì)細(xì)嫩，除了含有高蛋白、低脂肪外，還是含有大量?；撬岬牡蜔崃渴称贰Ｒ蚩梢种蒲械哪懝檀己?，預(yù)防成人病、緩解疲勞、恢復(fù)視力、改善肝臟功能而倍受人們的青睞。烏賊具有高營養(yǎng)、生活史較短（通常一年）、生長快和分布廣等特點(diǎn)，是一類很有發(fā)展前景的海水養(yǎng)殖種

60、類，也是海洋中最大、最具潛在價(jià)值的蛋白質(zhì)資源。</p><p>　　烏賊墨存在于墨囊中，是烏賊遇到天敵時(shí)噴出來染黑周圍水域的黑色物質(zhì)，以混亂天敵視野和麻痹天敵嗅覺，烏賊籍此方式逃生。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，烏賊墨具有多種生理活性，烏賊墨在“本草綱目”中記有“膚中墨主治血刺心痛”之功效?，F(xiàn)代臨床應(yīng)用證明它是一種良好的全身性止血藥，對(duì)婦科、外科、內(nèi)科等多種出血，止血效果顯著，無毒副作用。烏賊墨不僅可以止血，而且有可能通過有

61、效地控制出血使全身機(jī)能狀況改善，調(diào)動(dòng)機(jī)體自身調(diào)節(jié)功能，使功能恢復(fù)正常。同時(shí)對(duì)支氣管擴(kuò)張咯血、鼻出血、尿血、肺癌咯血、宮頸癌出血等也有一定的療效[2]。烏賊墨經(jīng)提取、分離和純化，得到了一種全新結(jié)構(gòu)的粘多糖，這種粘多糖與蛋白分子相連，構(gòu)成一種比較復(fù)雜的蛋白質(zhì)多糖復(fù)合體，是一種高效抗癌活性成分，說明烏賊墨具有抗腫瘤作用[3-5]。烏賊墨有抗輻射作用。烏賊墨可保護(hù)造血干細(xì)胞，有顯著促使環(huán)磷酞胺所致白細(xì)胞降低的回升作用，可預(yù)防大白鼠急性放射病[6

62、]。有日本學(xué)者指出在魷魚的腌制發(fā)酵產(chǎn)品中加入烏賊墨能顯著改善其保存性能，添加烏賊墨后使得魷魚在儲(chǔ)藏期間化學(xué)變化變慢[7]。國內(nèi)有學(xué)者研究表明，烏賊墨中的肽聚糖是發(fā)揮抗菌作用的主要物質(zhì)[8]。</p><p>　　烏賊墨的化學(xué)成分除了黑色素還有蛋白多糖復(fù)合體。多糖又稱為多聚糖，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，它存在于生物體一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的各種活動(dòng)，有多種多樣的生物學(xué)功能。多糖是由10個(gè)以上單糖通

63、過糖苷鍵連接而成的聚糖。多糖類物質(zhì)包括：糖原，甲殼素，肝素，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸角質(zhì)素，酸性粘多糖或糖胺聚糖。其中肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素都屬糖胺聚糖海洋動(dòng)物作為動(dòng)物多糖的重要來源之一，由于在體內(nèi)常以蛋白質(zhì)結(jié)合狀態(tài)存在，故也統(tǒng)稱為蛋白聚糖[9]，具有多種特殊的生物學(xué)功能。</p><p>　　多糖的提取目前常用堿解法、熱水浸提法、酶解法或堿解與酶解相結(jié)合的方法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法

64、。如劉興杰等[10]堿提取法從綠疣?？人姆N海洋無脊椎動(dòng)物中提取酸性粘多糖。陳菊嫡等[11]用堿解法提取分離花刺參酸性粘多糖；Mysore[12]用熱水浸提法提取高粱中的多糖。張紅巖等[13]用木瓜酶消化方法提取分離鹿茸中酸性多糖C. Maes等[14]用堿性過氧化氫提取小麥麩皮中的非淀粉多糖。唐孝禮等[15]用堿解與酶解相結(jié)合的方法提取分離黑海參酸性粘多糖。鄧永智[16]等利用微波輔助提取法從海水小球藻中提取多糖。鐘丹等[17]采用超

65、聲波提取牛蒡菊糖。由于烏賊墨汁多糖是一種動(dòng)物多糖，在體內(nèi)常以蛋白質(zhì)結(jié)合狀態(tài)存在，是一種蛋白聚糖，利用酶解法可以有效去除蛋白，并且具有條件溫和、得率高等優(yōu)點(diǎn)。因此本實(shí)驗(yàn)采用酶解法。</p><p>　　在我國，人們?cè)诔詾踬\時(shí)通常將墨囊棄去或把墨汁洗盡，同時(shí)隨著國內(nèi)水產(chǎn)加工業(yè)的發(fā)展，生產(chǎn)過程產(chǎn)生的下腳料逐年增多，烏賊墨也常作為下腳料被丟棄，造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。開發(fā)利用烏賊墨不僅可變廢為寶，獲得經(jīng)濟(jì)效益，還可以改善

66、環(huán)境，取得良好的社會(huì)效益。目前，研究烏賊墨汁多糖的相對(duì)較少。對(duì)烏賊墨汁多糖的提取工藝進(jìn)行研究，具有重要的實(shí)踐意義。</p><p><b>　　2 材料和方法</b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p><b>　　2.1.1 原料</b></p>&l

67、t;p>　　金烏賊 普通 寧波市江北區(qū)莊市菜市場</p><p><b>　　2.1.2 試劑</b></p><p>　　蒸餾水 二級(jí)水 寧波大學(xué)

68、 </p><p>　　濃硫酸 分析純 蘭溪市六洞山化工試劑廠 </p><p>　　氫氧化鈉 分析純 杭州市瓶窯和順化工試劑廠</p><p>　　苯酚

69、 分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　三氯乙酸 分析純 如皋市金陵試劑廠</p><p>　　堿性蛋白酶 20萬u/g 南京龐博生物工程有限公司</p>

70、<p>　　乙醇 96% 奧博生物有限公司</p><p>　　三氯乙酸溶液（15%）：稱取15g三氯乙酸于燒杯中，溶于水，移到100ml容量瓶中，用水稀釋到刻度。 </p><p>　　6%苯酚：取6ml苯酚與燒杯中，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度?，F(xiàn)配

71、先用。</p><p>　　2.1.3 主要儀器和設(shè)備</p><p>　　電熱恒溫水浴鍋 DK-S22型 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司</p><p>　　pH測(cè)量儀 delta 320 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司</p>

72、<p>　　分光光度計(jì) T6新銳 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司</p><p>　　分析天平 JD型 余姚市金諾天平儀器有限公司</p><p>　　高速冷凍離心機(jī) H2500R-2型

73、 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司</p><p>　　旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE52-2 上海滬西分析儀器廠</p><p>　　冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司</p><p>　　2.1.4 其他器材</p

74、><p>　　試管若干、錐形瓶若干、比色杯若干、比色管若干、試管架、滴定管、剪刀、移液管、鑷子、塞子若干、量筒、洗耳球、洗瓶等。</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 烏賊墨汁多糖的提取</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)的基本路線為：墨囊解凍擠出墨汁→加水，調(diào)pH值，加酶→水浴→滅酶

75、→離心取上清液→三氯乙酸除雜蛋白→離心取上清液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→乙醇沉淀→干燥得粗多糖</p><p>　　墨汁多糖提取工藝優(yōu)化：墨汁多糖提取單因素分析→墨汁多糖提取多因素正交試驗(yàn)分析→進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)</p><p>　　具體操作：將烏賊墨囊于4℃條件下解凍，從墨囊中擠出墨汁備用，稱取2g墨汁于錐形瓶中，加入蒸餾水，用氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液將溶液的pH調(diào)至8，然后加入一定量的堿性蛋白酶進(jìn)行酶解

76、，在特定溫度下水浴一段時(shí)間，結(jié)束后置于電磁爐上100℃條件下滅酶10min，將滅完酶的溶液用高速冷凍離心機(jī)下在9000r/min的條件下離心20min后取上清液，在上清液中加入四分之一體積的15%的三氯乙酸溶液過夜，加三氯乙酸的目的是，使多糖提取液中的蛋白質(zhì)與有機(jī)酸作用而變性沉淀[18]，從而提高多糖的純度。將加三氯乙酸過夜的溶液用高速冷凍離心機(jī)下在9000r/min的條件下離心20min后取上清液，將得到的上清液用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含

77、量，最后將上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，濃縮后的容易pH調(diào)至7，再加入濃縮液四倍體積的乙醇讓多糖沉淀，將沉淀進(jìn)行冷凍干燥后得到微黃色樣品，即為墨汁粗多糖。</p><p>　　2.2.2 苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量</p><p>　　多糖的含量測(cè)定的方法可分為兩大類[19]：一類是直接測(cè)定法，如高效液相色譜法和酶法；另一類是利用組成多糖的單糖縮合反應(yīng)而建立的方法，如苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等

78、。本實(shí)驗(yàn)采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量。苯酚-硫酸法的原理為：糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，其顏色深淺與糖的含量成正比，且在490nm波長下有最大吸收峰，在此波長下測(cè)定吸光度，進(jìn)而得到糖含量。</p><p>　　2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備</p><p>　　準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖100mg于100ml容量瓶中，加水至刻度，取10ml定容至100ml

79、分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，各以蒸餾水補(bǔ)至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml，搖勻冷卻，室溫放置20分鐘以后于490nm測(cè)吸光度，以2.0ml水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為多糖。單位為μg/ml?？v坐標(biāo)為吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：y=0.0076X-0.0037 ，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，如圖1所示。</p><p>　　圖 1多糖含

80、量標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　Figure1 The standard curve of Polysaccharide content</p><p>　　2.2.4 多糖含量的測(cè)定</p><p>　　每次取1g樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按2.2.1中的實(shí)驗(yàn)步驟得到加了三氯乙酸過夜的溶液，置于高速冷凍離心機(jī)下在9000r/min的條件下離心20min后取上清液，將上清液定容

81、至100毫升的容量瓶中。再吸取10ml于50ml容量瓶中，從中吸取1ml的樣品液，以蒸餾水補(bǔ)至2.0ml，然后在通風(fēng)櫥中操作，向各個(gè)管中用移液槍加入6%苯酚1.0ml，用移液管向各個(gè)管中加入濃硫酸5.0ml，搖勻冷卻后，在室溫下放置20分鐘以后，用分光光度計(jì)于490nm波長下測(cè)定吸光度。每次測(cè)定取雙樣對(duì)照。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。</p><p>　　多糖提取率（%）=100×m×50/（0.

82、1M×106）= m/(20×M)</p><p>　　式中：m----經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的多糖含量，單位為微克（μg/ml）</p><p>　　M----樣品質(zhì)量，單位為克（g）</p><p>　　2.2.5 墨汁多糖提取條件優(yōu)化</p><p>　　針對(duì)加酶量、料水比、提取溫度、提取時(shí)間、pH值這五個(gè)條件對(duì)墨汁多糖提取

83、的影響，分別對(duì)這五個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，在保持其他提取條件不變的情況下，分析在各自單一變量條件下的最佳提取值。根據(jù)這五個(gè)條件的單因素分析結(jié)果，再確定其中四個(gè)因素及其水平條件進(jìn)行正交試驗(yàn)，分析確定最佳的提取條件及各提取條件對(duì)烏賊墨汁多糖的提取的影響程度，最后根據(jù)分析所得的最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。</p><p><b>　　3 結(jié)果和討論</b></p><p>　　

84、3.1 加酶量對(duì)墨汁多糖提取的影響</p><p>　　采用堿性蛋白酶作為提取多糖的添加酶（其最適反應(yīng)pH為8，比活為20萬u/g）。在料水比為1:10，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為2h的條件下，堿性蛋白酶的加入量分別為原料質(zhì)量的2.5%，3.0%，3.5%，4%，4.5%，5%六個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟，加三氯乙酸過夜后再離心取得的上清液在490nm條件下測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。</p>

85、<p>　　圖2加酶量對(duì)墨汁多糖提取的影響</p><p>　　Figure2 The effects of enzyme concentration on extraction of polysaccharides</p><p>　　由圖2可以看出，在料水比為1:10，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為2h的條件保持不變的情況下，隨著酶用量的增加，多糖的提取率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì)

86、至添加量為4%時(shí)曲線增幅變緩，這表明添加量至4%時(shí)，對(duì)多糖的提取影響變?nèi)?，綜合經(jīng)濟(jì)方面的考慮，選用加酶量為原料量的4%為此因素的條件。</p><p>　　3.2 料水比對(duì)墨汁多糖提取的影響</p><p>　　在堿性蛋白酶的加入量為原料重的4.5%，pH為8，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為2h的條件下，料水比分別為1:5，1:10，1:15，1:20，1:25五個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟

87、，加三氯乙酸過夜后再離心取得的上清液在490nm條件下測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。</p><p>　　由圖3可以看出，在堿性蛋白酶的加入量為原料重的4.5%，pH為8，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為2h的條件保持不變的情況下，隨著料水比的增加，多糖提取率先增大后減小，并在料水比為20時(shí)達(dá)到最大，多糖提取效果最好，因此選用料水比20時(shí)為此因素的條件。</p><p>　　圖3料水比對(duì)墨汁多

88、糖提取的影響</p><p>　　Figure3 The effects of the ratio of raw materials and water on extraction of polysaccharides</p><p>　　3.3 pH對(duì)墨汁多糖提取的影響</p><p>　　在堿性蛋白酶的加入量為原料重的4.5%，料水比1:10，提取溫度為40℃，

89、提取時(shí)間為2h的條件下，pH分別為7，8，9，10，11五個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟，加三氯乙酸過夜后再離心取得的上清液在490nm條件下測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。</p><p>　　圖4 pH對(duì)墨汁多糖提取的影響</p><p>　　Figure4 The effects of pH on extraction of polysaccharides</p><

90、p>　　由圖4可以看出，在堿性蛋白酶的加入量為原料重的4.5%，料水比1:10，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為2h的條件保持不變的情況下，隨著pH的增加，多糖提取率在pH8-10之間變化不大，pH大于10時(shí)迅速減小，并在pH為8時(shí)達(dá)到最大，這是因?yàn)閴A性蛋白酶的最適pH為8左右，當(dāng)pH大于10時(shí)，堿性蛋白酶發(fā)生變性，導(dǎo)致多糖提取率下降。因此實(shí)驗(yàn)時(shí)保持溶液的pH為8-10時(shí)對(duì)結(jié)果影響不大。 </p><p>　　

91、3.4 提取溫度對(duì)墨汁多糖提取的影響</p><p>　　在堿性蛋白酶的加入量為原料重的4.5%，pH為8，料水比為1:10，提取時(shí)間為2h的條件下，提取溫度分別為30℃，40℃，50℃，60℃，70℃五個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟，加三氯乙酸過夜后再離心取得的上清液在490nm條件下測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。</p><p>　　圖5提取溫度對(duì)墨汁多糖提取的影響</p>

92、<p>　　Figure5 The effects of temperature on extraction of polysaccharides</p><p>　　由圖5可以看出，在堿性蛋白酶的加入量為原料重的4.5%，pH為8，料水比為1:10，提取時(shí)間為2h的條件保持不變的情況下，隨著溫度的增加，多糖提取率先增大后減小，并在提取溫度為50℃時(shí)達(dá)到最大，多糖提取效果最好，因此選用提取溫度為50℃

93、時(shí)為此因素的條件。</p><p>　　3.5 提取時(shí)間對(duì)墨汁多糖提取的影響</p><p>　　在堿性蛋白酶的加入量為原料重的4.5%，pH為8，料水比為1:10，提取溫度為40℃的條件下，提取時(shí)間分別為1h，2h，3h，4h，5h五個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟，加三氯乙酸過夜后再離心取得的上清液在490nm條件下測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。</p><p>　

94、　圖6提取時(shí)間對(duì)墨汁多糖提取的影響</p><p>　　Figure6 The effects of time on extraction of polysaccharides</p><p>　　由圖6可以看出，在堿性蛋白酶的加入量為原料重的4.5%，pH為8，料水比為1:10，提取溫度為40℃的條件保持不變的情況下，隨著提取時(shí)間的增加，多糖提取率先增大后減小，并在提取時(shí)間為3h時(shí)達(dá)到最

95、大，多糖提取效果最好，因此選用提取時(shí)間為3h時(shí)為此因素的條件。</p><p>　　3.6 多糖提取正交實(shí)驗(yàn)分析</p><p>　　根據(jù)之前所做的單因素實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果分析。選擇料水比、加酶量、提取溫度、提取時(shí)間四個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。確定四因素三水平L9(34)的正交試驗(yàn)中四個(gè)因素的水平分別為，料水比：1:15，1:20，1:25；加酶量：3.5％，4.0％，4.5％；提取溫度：40℃，50

96、℃，60℃；提取時(shí)間：2h，3h，4h。具體因素水平見表1：</p><p>　　表1 正交因素水平表</p><p>　　Table1 The level of orthogonal factors </p><p>　　按照四因素三水平L9(34)正交表的實(shí)驗(yàn)設(shè)置進(jìn)行9次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中為避免誤差過大，每次實(shí)驗(yàn)都做了3組平行取平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀分析見表2，方差分

97、析見表3：</p><p>　　表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和直觀分析</p><p>　　Table2 The Results of orthogonal experiments and visual analysis</p><p>　　表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表</p><p>　　Table3 Variance analysis of ortho

98、gonal experiment</p><p>　　從表2的直觀分析中的極差數(shù)據(jù)可知，本次實(shí)驗(yàn)中針對(duì)的料水比、加酶量、提取溫度、提取時(shí)間四個(gè)實(shí)驗(yàn)條件中，影響墨汁多糖提取的因素主次關(guān)系為：B（加酶量）＞C（提取溫度）＞D（提取時(shí)間）＞A（料水比）。由于吸光度越大，溶液中被提取出來的多糖含量越高。因此從表2中確定實(shí)驗(yàn)的墨汁多糖的最佳提取方案為：A3B3C2D3 。也就是料水比為1:25、加酶量為原料量的4.5%、提

99、取溫度為50℃、提取時(shí)間為4h。另外，表3的方差分析表明墨汁多糖提取因素中的加酶量對(duì)墨汁多糖的提取的影響存在著顯著的差異（α=0.10），顯著水平差異值的結(jié)果與極差分析結(jié)果一致。</p><p><b>　　3.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) </b></p><p>　　根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)分析得出的墨汁多糖最佳提取方案A3B3C2D3 為：料水比為1:25、加酶量為原料量的4.5

100、%、提取溫度為50℃、提取時(shí)間為3h。這個(gè)實(shí)驗(yàn)各因素水平的組合在正交試驗(yàn)中沒有出現(xiàn)，須通過實(shí)際實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證理論分析的結(jié)果，故做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證正交實(shí)驗(yàn)中的分析結(jié)果是否完全正確。</p><p>　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟，加三氯乙酸過夜后離心取得的上清液，用苯酚硫酸法在490nm條件下測(cè)吸光度，再根據(jù)公式求得多糖提取率。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表4所示。</p><p><b>　　表4 驗(yàn)證實(shí)

101、驗(yàn)結(jié)果</b></p><p>　　Table4 The Result of Verification experiment</p><p>　　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的3組平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在料水比為1:25、加酶量為4.5%、提取溫度為50℃、提取時(shí)間為4h的條件下，在490nm下測(cè)得的吸光度的平均值為0.548。根據(jù)公式得出多糖的提取率為3.63%。這說明正交實(shí)驗(yàn)分析得出的最佳提取方案

102、：A3B3C2D3，即料水比為1:25、加酶量為原料量的4.5%、提取溫度為50℃、提取時(shí)間為4h是正確的。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)選用金烏賊墨汁多糖的提取作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，在眾多的影響多糖提取的條件中挑選了加酶量、料水比、pH、提取溫度、提取時(shí)間作為實(shí)驗(yàn)的研究因素，在保持其他條件不變的情況下，先依次對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行單因

103、素分析確定各自的最佳因素水平。然后根據(jù)單因素分析的結(jié)果，最終合理設(shè)置了四因素三水平的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，我們確定了影響墨汁多糖提取即影響墨汁多糖提取率因素主次關(guān)系為：B（加酶量）＞C（提取溫度）＞D（提取時(shí)間）＞A（料水比）。并且通過實(shí)際的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明了正交實(shí)驗(yàn)分析的最佳提取方案為料水比為1:25、加酶量為原料量的4.5%、提取溫度為50℃、提取時(shí)間為4h的正確性。并且計(jì)算得出，在此提取條件下，墨汁多糖的提取

104、率為3.63%。</p><p>　　但是由于D（提取時(shí)間）和A（料水比）對(duì)多糖提取的影響并不顯著且各自的k值相差較小，為減少提取時(shí)間提高提取效率和減少用水量，考慮成本問題，在實(shí)際應(yīng)用中可采用加酶量為原料量的4.5%，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為2h，料水比為1:15。</p><p><b>　　5 展望</b></p><p>　　多糖的研

105、究具有巨大的潛力。多糖是從機(jī)體中制取的天然生物高分子，與人體細(xì)胞有良好的生物兼容性，不具有毒性而且可以被生物體分解，具有生物活性，因此可廣泛地應(yīng)用在醫(yī)藥食品等方面。如針對(duì)眾多的多糖類疾病，人們?cè)诶猛庠葱詣?dòng)物中氨基多糖的生物活性研制有效藥物方面進(jìn)行了嘗試。一些藥用氨基多糖已在臨床治療中應(yīng)用，如用于治療心腦血管疾病的藥物—肝素[20]。從中國林蛙皮[21]中分離提取的透明質(zhì)酸無毒無害，可將其作為保濕嫩膚型化妝品的添加劑，也可將其應(yīng)用于保健

106、食品的生產(chǎn)。</p><p>　　我國對(duì)多糖的研究起步較晚，但近年來的工作取得了較大的進(jìn)展，越來越多的多糖被發(fā)現(xiàn)。并被證實(shí)它們具有復(fù)雜、廣泛的生物活性和功能。隨著對(duì)多糖生物活性研究的不斷深入，多糖的生物活性機(jī)理，功效因子等會(huì)更加明確，它的應(yīng)用領(lǐng)域也將會(huì)更加寬闊。然而，由于多糖本身結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜且種類繁多，其提取分離純化有很大的難度，有些動(dòng)物多糖在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)不易分離及多糖的藥理作用與諸多因素有關(guān)，給多糖的研究和應(yīng)用帶

107、來許多的挑戰(zhàn)，這需要相關(guān)行業(yè)的人士不斷地開拓創(chuàng)新，共同努力。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 董正之主編.中國動(dòng)物志(軟體動(dòng)物門).北京:科學(xué)出版社,1988:106.</p><p>　　[2] 謝光臨,呂昌龍,洪明標(biāo)等.烏賊墨促凝血作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1994,23(6):

108、530-531.</p><p>　　[3] 呂昌龍,洪明標(biāo),鐘建國等.烏賊墨對(duì)小鼠移植瘤的抑制作用[J].實(shí)用腫瘤學(xué)雜志,1994, 8(1):6-7.</p><p>　　[4] 蘇偉明,馬潤娣,于立堅(jiān)等.中國槍烏賊墨汁提取物的抗腫瘤作用[J].中國海洋藥物雜志,2005,24(2):47-50.</p><p>　　[5] 黃枚.烏賊墨抗癌活性的實(shí)驗(yàn)研究[J]