土壤酶活測(cè)定及土壤微生物總蛋白的提取、純化與鑒定.pdf

1、土壤酶是土壤的組成成分之一。土壤酶的活性與土壤物理特性、水熱狀況、土壤的有機(jī)、無機(jī)組分的化學(xué)組成及吸收性復(fù)合體的特征等有著密切的相關(guān)性。元蛋白質(zhì)組學(xué)是近年出現(xiàn)的一種基于蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)微生物群落進(jìn)行研究的新技術(shù),其定義為對(duì)特定環(huán)境混合微生物群落的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行的即時(shí)的、大規(guī)模的分析。雖然目前對(duì)元蛋白質(zhì)組學(xué)的研究還處在起步階段,但是它已在特定生境的微生物研究中顯現(xiàn)出其強(qiáng)大的功能。本文通過對(duì)不同施肥條件下土壤酶活性進(jìn)行測(cè)定,了解胞內(nèi)和胞外酶的組

2、成;利用密度梯度離心法提取、純化土壤菌體,超聲波破碎獲取菌體蛋白,再進(jìn)行超濾、TCA沉淀等純化菌體蛋白,通過SDS-PAGE技術(shù)分離土壤菌體蛋白;用2D-PAGE技術(shù)進(jìn)一步分離純化菌體蛋白,獲取質(zhì)量較好的電泳圖譜,分析不同處理?xiàng)l件下土壤菌體蛋白的差異性及共同性,利用MS方法鑒定蛋白,通過數(shù)據(jù)查詢與分析比對(duì),解釋土壤蛋白質(zhì)的可能生物來源。
　　 紅壤水稻土在不施肥(CK)、施NPK肥(NPK)以及施豬糞肥(M)三種處理?xiàng)l件下,其生

3、物量、理化性質(zhì)等都發(fā)生改變,土壤酶活性也存在著差異。不施肥土樣脲酶活性為0.074mg NH3-N·g-1土.3h-1,施NPK肥的為0.108mg NH3-N·g-1土·3h-1,施豬糞的土樣脲酶活性為0.191mg NH3-N·g-1土.3h-1;不施肥、施NPK肥和施豬糞土樣蛋白酶活性分別為2.78μg Tyr·g-1土.48h-1,7.55μg Tyr·g-1土.48h-1,8.22μg Tyr·g-1土.48h-1;不施肥,施

4、NPK肥和施豬糞土樣蔗糖酶活性分別為1.06 mg Glu·g-1土,1.08 mg Glu·g-1土、1.35 mg Glu·g-1土。對(duì)土壤微生物酶活性測(cè)定表明:胞內(nèi)脲酶活性遠(yuǎn)大于胞外脲酶活性,胞外脲酶活性是CK＜NPK＜CK+滅菌土＜M＜NPK+滅菌土＜M+滅菌土,同一種土樣,加入滅菌土后胞外脲酶活性明顯增高;不同的土樣,豬糞處理比化肥處理胞內(nèi)脲酶活性增幅大。胞內(nèi)脲酶活性是CK＜CK+滅菌土＜NPK＜NPK+滅菌土＜M＜M+滅菌土

5、;與胞外酶基本相同,同一種土樣,加入滅菌土后胞內(nèi)脲酶活性也明顯增高;不同的土樣,豬糞處理比化肥處理脲酶活性增幅大。
　　 實(shí)驗(yàn)分別對(duì)三種施肥處理的紅壤樣品,以及每種土樣提取的菌體進(jìn)行平板計(jì)數(shù)和DAPI計(jì)數(shù),計(jì)算每克土壤中所含的菌體數(shù)量,結(jié)果表明DAPI計(jì)數(shù)要比平板計(jì)數(shù)高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。通過密度梯度離心法獲取土樣菌體蛋白量為:CK土樣中提取的微生物總蛋白量最低為0.4μg·g-1土,施N=PK肥以及施豬糞肥土樣中蛋白含量較高,分別為0

6、.68μg·g-1土,0.78μg·g-1。通過SDS-PAGE能觀察到三種土樣的蛋白差異性,蛋白主要集中在44.32 Kda和92.7 Kda之間。
　　 由于樣品蛋白提取中,仍有腐植酸類雜質(zhì)難以去除,二維電泳過程中須選用低鹽離子濃度的緩沖液純化蛋白,采用低溫高速離心去除干擾蛋白溶解的一些雜質(zhì),選用4℃,12000 r/min離心1h能獲得較好的離心效果,進(jìn)而取得質(zhì)量較好的電泳圖譜。質(zhì)譜鑒定了三種不同處理土樣中的3種共同蛋白,