苯并[α]芘對(duì)櫛孔扇貝分子毒理學(xué)機(jī)制的研究.pdf

1、本文根據(jù)目前我國(guó)近海多環(huán)芳烴污染現(xiàn)狀，選擇近海養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)貝類櫛孔扇貝(Chlamys farreri)為研究對(duì)象，克隆了櫛孔扇貝的幾種解毒代謝相關(guān)基因，包括芳烴受體蛋白(AhR)、混合功能氧化酶中的CYP4、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶中的GSTpi和外源物質(zhì)抗性蛋白Pgp。研究了苯并[α]芘(BαP)作用下櫛孔扇貝組織內(nèi)BαP累積規(guī)律、解毒代謝酶的表達(dá)調(diào)控規(guī)律以及DNA損傷效應(yīng)，并結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究解毒代謝酶在DNA損傷形成中的作用，探討B(tài)αP

2、對(duì)櫛孔扇貝的致毒的分子機(jī)制。本研究可為近海多環(huán)芳烴生物標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)的建立提供理論依據(jù)，為解析多環(huán)芳烴對(duì)貝類的毒理學(xué)機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。
　　 櫛孔扇貝芳烴受體蛋白ChfAhR的cDNA全長(zhǎng)為2891bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?466bp，編碼821個(gè)氨基酸殘基，無(wú)信號(hào)肽，為胞內(nèi)蛋白，含有三個(gè)核定位序列。BLAST分析表明ChfAhR與其它物種AhR基因具有較高的同源性，預(yù)測(cè)的蛋白結(jié)構(gòu)與其它已知物種相似。ChfAhR含有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)

3、(DNA結(jié)合區(qū))和PAS結(jié)構(gòu)域(配體結(jié)合區(qū))，屬于bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族。序列分析表明，ChfAhR的bHLH-PAS功能區(qū)與無(wú)脊椎動(dòng)物相似性較高，與脊椎動(dòng)物相似性較低。半定量RT-PCR分析表明ChfAhR在消化盲囊中有較高的表達(dá)，其次在成熟♀性腺中，鰓、外套膜和閉殼肌中表達(dá)量較少。
　　 櫛孔扇貝CYP450基因ChfCYP4的cDNA全長(zhǎng)為1927bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?317bp，編碼438個(gè)氨基酸殘基，為胞內(nèi)蛋白，含

4、有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位信號(hào)位點(diǎn)。BLAST分析表明ChfCYP4與其它物種ChfCYP4基因具有較高的同源性，預(yù)測(cè)的蛋白結(jié)構(gòu)與其它已知物種相似。ChfCYP4推導(dǎo)的氨基酸序列中存在細(xì)胞色素P450家族半胱氨酸血紅素鐵簽名序列(F461SAGPRNCIG470)，簽名序列中血紅素鐵結(jié)合位點(diǎn)Cys386高度保守。半定量RT-PCR分析表明ChfCYP4在成熟♀性腺和外套膜中有較高的表達(dá)，其次在鰓、消化盲囊和閉殼肌中也有一定的表達(dá)量。
　　

5、櫛孔扇貝GSTpi基因ChfGSTpi的cDNA全長(zhǎng)為692bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?18bp，編碼205個(gè)氨基酸殘基，為胞內(nèi)蛋白。BLAST分析表明ChfGSTpi與其它物種GSTpi基因具有較高的同源性，預(yù)測(cè)的蛋白結(jié)構(gòu)與其它已知物種相似。ChfGSTpi氨基酸序列包括位于氮端的谷胱甘肽結(jié)合區(qū)(GSH binding site，G-site)和碳端的外源物質(zhì)非特異性結(jié)合位點(diǎn)(H-site)，配體結(jié)合活性位點(diǎn)Tyr109高度保守。半定量RT-

6、PCR分析表明ChfGSTpi在外套膜中表達(dá)量最高，在其它組織中也有較高的表達(dá)。
　　 櫛孔扇貝ChfPgp部分片段cDNA為1345bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?30bp，編碼210個(gè)氨基酸殘基。BLAST分析表明ChfPgp與其它物種Pgp基因的相應(yīng)片段同源性較高，預(yù)測(cè)的蛋白結(jié)構(gòu)與其它已知物種相似。ChfPgp氨基酸序列包括位于氮端的ATP結(jié)合區(qū)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)位點(diǎn)L107SGGQKQRVA116等保守區(qū)域。半定量RT-PCR分析表明Ch

7、tPgp在外套膜中表達(dá)量最低，在其它各組織中均有較高的表達(dá)。
　　 BαP(0.05、0.2、0.8pg/L)染毒10d清除5d測(cè)得的櫛孔扇貝消化盲囊中的BαP累積量顯著高于軟體部中的累積量，濕重表示時(shí)，消化盲囊中BαP累積量約為軟體部中BαP累積量11.8倍減5.9，干重表示時(shí)，消化盲囊中BαP累積量約為軟體部中BαP累積量5.7倍加0.2。BαP脅迫對(duì)BαP累積量、GSTpi表達(dá)水平和DNA加合物含量的影響具有時(shí)間劑量效應(yīng)，

8、GSTpi表達(dá)水平、DNA加合物含量和8-OHdG含量與組織中BaP累積呈顯著正相關(guān)，DNA加合物/8OHdG-BaP累積量回歸曲線為指數(shù)方程，BaP累積量-GSTpi表達(dá)量回歸曲線為雙曲線單矩三因子方程。ChfAhR和ChfCYP4表達(dá)變化未見(jiàn)明顯的時(shí)間-劑量效應(yīng)，與組織累積量的相關(guān)性亦不顯著，但顯示了BaP對(duì)ChfAhR表達(dá)具有一定的誘導(dǎo)作用而對(duì)ChfCYP4具有一定的抑制作用，由結(jié)果可見(jiàn)GSTpi、DNA加合物和8-OFtdG與B