人工納米氧化鋅顆粒對牙鲆FG細(xì)胞和斑馬魚胚胎的毒性及其毒性作用機制.pdf

1、納米氧化鋅(nZnO)因具有獨特的光催化作用、紫外吸收能力和殺菌作用，已被廣泛地運用到人類日常用品中，如紡織品、化妝品、牙膏和抗菌劑等，由其所引起的生物毒性效應(yīng)也引起了人們的廣泛關(guān)注。本文擬利用海水魚類牙鲆的鰓細(xì)胞系(FG)來比較研究3種粒徑的ZnO顆粒(30 nm、80-150 nm和2μm)的細(xì)胞毒性效應(yīng)，利用斑馬魚胚胎來比較研究這3種粒徑ZnO顆粒的胚胎毒性，以了解ZnO顆粒的毒性效應(yīng)與其粒徑大小的關(guān)系。在細(xì)胞毒性檢測中，采用MT

2、T法、乳酸脫氫酶(LDH)檢測法和Hoechst33342/PI雙熒光染色法及DNA片段化法，來分別檢測這3種粒徑的ZnO顆粒對FG細(xì)胞的生長抑制、細(xì)胞膜損傷和凋亡誘導(dǎo)能力。在胚胎毒性檢測中，觀察這3種粒徑的ZnO顆粒對斑馬魚胚胎孵化率和致畸性的影響。為了探討ZnO顆粒的毒性與其鋅離子(Zn2+)釋放量的相關(guān)性，本文還研究了ZnCl2對FG細(xì)胞的毒性，以及不同處理濃度下3種粒徑ZnO顆粒在PBS中的鋅離子(Zn2+)釋放量。為了探討這3

3、種粒徑ZnO顆粒的團聚效應(yīng)與其毒性的關(guān)系，本文還比較研究了超聲波處理和血清對ZnO顆粒團聚程度及其毒性效應(yīng)的影響。本文的研究結(jié)果為進(jìn)一步加深人們對納米ZnO顆粒的毒性及其致毒機制的了解，為人工納米材料的環(huán)境污染生物檢測系統(tǒng)的建立奠定基礎(chǔ)。
　　 MTT分析的結(jié)果表明，3種ZnO顆粒都可以抑制FG細(xì)胞的生長，而且這種抑制作用具有明顯的濃度依賴性和時間依賴性。30 nm、80-150 nm和2μm ZnO顆粒對FG細(xì)胞的24 h的I

4、C50(半數(shù)抑制濃度)值分別為：5.136(3.9-6.8)、5.826(4.1-8.3)和6.473(4.3-9.7)μg/ml(95％的置信區(qū)間)，毒性大小為30 nm>80-150 nm>2μm。可見，3種粒徑ZnO顆粒對FG細(xì)胞生長的抑制作用表現(xiàn)出了明顯的粒徑效應(yīng)，隨著ZnO顆粒粒徑的減小而毒性增大；而且ZnO顆粒的濃度越低，這種粒徑效應(yīng)越明顯。LDH分析的結(jié)果表明，隨著ZnO顆粒濃度的升高，3種粒徑ZnO顆粒處理組的FG細(xì)胞培

5、養(yǎng)上清中的LDH活性也隨之增加，具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，LDH相對活性最低在25％左右，最高在50％左右。這表明FG細(xì)胞的細(xì)胞膜的完整性發(fā)生了改變，使存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的LDH泄露到培養(yǎng)基中。Hochest33342/PI雙熒光染色的結(jié)果也表明，3種粒徑的ZnO顆粒都可以引起FG細(xì)胞的凋亡和壞死。隨著濃度的增高，每種粒徑的ZnO顆粒所引起的FG細(xì)胞的凋亡和死亡的細(xì)胞總數(shù)都逐漸增加，具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。而且，即使每種粒徑的ZnO顆粒在高濃

6、度(100和50μg/ml)時出現(xiàn)較多的死細(xì)胞，但其毒性都是以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為主。在所檢測的暴露濃度條件下，3種粒徑的ZnO顆粒雖然誘導(dǎo)了FG細(xì)胞的凋亡，但還沒有引起基因組DNA的片段化。
　　 三種粒徑ZnO顆粒在PBS中的鋅離子釋放量的檢測結(jié)果表明30nm、80-150nm和2μm的ZnO顆粒在PBS中都會溶解出Zn2+，且隨著ZnO顆粒濃度的增高，釋放量也逐漸增加。MTT法檢測不同濃度氯化鋅(ZnCl2)對FG細(xì)胞的細(xì)胞毒性

7、結(jié)果表明，ZnCl2對FG細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，而且隨著ZnCl2濃度的升高，抑制作用逐漸增強，細(xì)胞的活性逐漸降低。30 nm、80-150nm和2μm的ZnO顆粒及ZnCl2的IC50值分別為0.08、0.072、0.063、0.075μmol/ml，而30 nm、80-150 nm和2μm的ZnO顆粒在最高濃度100μg/ml時Zn2+的釋放量分別為：1.12±0.054，1.86±0.08和1.54±0.065μg/ml，即

8、0.023±0.001，0.029±0.0012和0.017±0.0008μmol/ml均沒有超過0.03μmol/ml，與其IC50值相比，此濃度不足以引起實驗中所測得的毒性，因此，我們認(rèn)為ZnO顆粒所釋放的Zn2+產(chǎn)生的毒性只是導(dǎo)致ZnO顆粒產(chǎn)生毒性的部分原因。本文比較了經(jīng)超聲波處理和未處理的30 nm、80-150 nm和2μm的ZnO顆粒對FG細(xì)胞的毒性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲波處理的3種ZnO顆粒對FG細(xì)胞的毒性效應(yīng)要明顯高于未經(jīng)超聲波處

9、理的3種粒徑ZnO顆粒的毒性，且這種差異在高濃度(100和50μg/ml)時更為顯著，這表明，超聲波處理后有利于ZnO顆粒的分散，使其易于穿透細(xì)胞膜，而不經(jīng)超聲波處理的ZnO顆粒會團聚成較大的團塊，從而降低其穿透細(xì)胞膜的能力和數(shù)量，因而毒性降低。本文還發(fā)現(xiàn)血清有助于降低ZnO顆粒的團聚程度，從而影響ZnO顆粒的細(xì)胞毒性結(jié)果?？傊?，ZnO顆粒的團聚程度也是影響其毒性效應(yīng)的重要因素。
　　 3種粒徑ZnO顆粒對斑馬魚的胚胎毒性結(jié)果表

10、明，3種粒徑的ZnO顆粒均會影響斑馬魚胚胎的發(fā)育，造成處理組斑馬魚胚胎9 h時發(fā)育停滯，而且發(fā)育停滯的胚胎在24 h后大部分死亡；在受精72 h后，3種粒徑ZnO顆粒處理組胚胎的孵化率相比對照組出現(xiàn)了明顯的降低；3種粒徑ZnO顆粒對斑馬魚胚胎的致畸率和死亡率沒有明顯的濃度依賴性，且9 h時的致畸率和24 h時的死亡率相似；3種粒徑ZnO顆粒對斑馬魚胚胎的孵化率的影響具有明顯的濃度依賴性，在高濃度(100和50μg/ml)時，斑馬魚胚胎的

11、孵化率都為零，但是在10μg/ml時，30 nm、80-150 nm和2μm的ZnO顆粒處理的斑馬魚胚胎的孵化率分別為0，11.54％±2.2％，36.7％±7.3％，說明隨著ZnO顆粒粒徑的減小，對斑馬魚胚胎孵化率的影響增大。
　　 總之，本文通過比較研究3種粒徑ZnO顆粒對體外培養(yǎng)FG細(xì)胞的細(xì)胞毒性及其對斑馬魚胚胎的胚胎毒性，發(fā)現(xiàn)這3種粒徑的ZnO顆粒對FG細(xì)胞的細(xì)胞毒性與其粒徑大小、所釋放的Zn2+濃度和團聚程度有關(guān)。粒徑