微懸臂梁陣列在細胞牽引力測量中的應用

1、<p>　　微懸臂梁陣列在細胞牽引力測量中的應用</p><p>　　作者：周治國，劉志文，范哲意</p><p>　　【摘要】 精確測量細胞牽引力的大小及分布對細胞生物學、組織工程等研究具有重要意義。近年來，基于生物微機電系統(tǒng)技術制作的高深寬比聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 微懸臂梁陣列作為細胞牽引力測量傳感器受到廣泛關注。不同于傳統(tǒng)基于連續(xù)基質(zhì)的測量方法，細胞在致密、垂直、離

2、散的微懸臂梁陣列頂端貼附并延展、遷移，引起微懸臂梁形變。通過對掃描電子顯微鏡圖像處理，細胞牽引力測量精度可以達到數(shù)十 nN/m。我們綜述了基于微懸臂梁陣列細胞牽引力傳感器測量方法，重點論述了實驗原理、制作工藝和細胞實驗，并討論了微懸臂梁陣列結(jié)構(gòu)倒塌機理。 </p><p>　　【關鍵詞】 細胞牽引力；生物微機電系統(tǒng)；聚二甲基硅氧烷；微懸臂梁陣列；圖像處理</p><p>　　Abstra

3、ct：Cell traction forces (CTFs) precision measurement is significant for many research fields such as cell biology and tissue engineering and so on. In recent years, enabled by the advancement in the Biological Micro Elec

4、tromechanical Systems (BioMEMS) technology, high-aspect-ratio polydimethylsiloxane (PDMS) microcantilever array devices which serve as CTFs sensors have been widely concerned. Rather than conventional continuous substrat

5、es, cell attached and spread across multiple discrete </p><p>　　Key words：Cell traction force;Biological micro electromechanical systems;Polydimethylsiloxane;Microcantilever array; Image processing</p>

6、<p><b>　　1 引 言</b></p><p>　　細胞通過焦點粘附傳遞納牛頓量級牽引力到底層基材［1］。細胞牽引力在細胞遷移和細胞形態(tài)保持中起關鍵作用，在許多生物學過程中扮演了基礎角色，比如新生血管生成，胚胎形成，炎癥和傷口愈合等。過去幾十年來，許多方法用來在亞細胞層面測量細胞牽引力。根據(jù)引起細胞形變所采用的技術可以分為兩大類：主動方法和被動方法。主動方法使用外力

7、使細胞產(chǎn)生形變來測量細胞牽引力，其中有原子力顯微鏡方法［2］和微吸管方法［3］；被動方法采用傳感器來被動探測細胞產(chǎn)生的力，包括彈性基材法［4］和微珠柵格圖案法［5-6］。原子力顯微鏡法利用固定在柔性懸臂梁上的探針來探測細胞，可以觀測細胞和探針的相對形變，以計算施加于細胞上的力大小和細胞硬度。這種方法的缺點是測量探針容易破壞細胞。微吸管法用微吸管吮吸細胞，由于真空吸力使細胞產(chǎn)生形變。施加的力可以通過形變量計算得出，細胞的機械特性也可以由測

8、量到的數(shù)據(jù)推算得出。彈性基材法通過人造柔性基材來測量單個細胞的牽引力。當細胞貼附、遷移時，將產(chǎn)生牽引力并會對硅樹脂基材拉扯，通過觀測基材所造成的皺折形變來測量細胞的力學行為。這種方法存在許多測量技術上的限制，當力作用在相同平面基材的不同方向上時</p><p>　　隨著BioMEMS 技術的進步，近年來經(jīng)過表面處理高深寬比 PDMS 微懸臂梁陣列被開發(fā)出來作為傳感器，用來探測細胞牽引力及在體外研究細胞的機械性質(zhì)［

9、7-10］。采用微加工工藝在硅片上制作模具，復脫模法制作 PDMS 微懸臂梁陣列。細胞貼附在微懸臂梁陣列頂端，在多個微懸臂梁頂端間延展遷移，該過程會造成微懸臂梁陣列發(fā)生彎曲形變。采用這種致密、垂直、離散微懸臂梁陣列結(jié)構(gòu)替代傳統(tǒng)連續(xù)測量介質(zhì)，在基材面上，每個接觸到細胞的微懸臂梁作為獨立的力學傳感器單元來測量細胞牽引力，通過對微懸臂梁陣列形變的顯微圖像處理，細胞牽引力可以被直接定性、定量測量，精度可以達到數(shù)十 nN/μm。</p>

10、;<p><b>　　2 測量原理</b></p><p>　　圖1是細胞在微懸臂梁陣列頂端貼附、延展及微懸臂梁形變示意圖。微懸臂梁在小形變范圍內(nèi)形變可視作線性彈性形變，形變量正比于細胞牽引力。根據(jù)線性彈性理論［11］，圓柱體微懸臂梁半徑r,高度L,在外力F作用下彎曲產(chǎn)生形變，具體公式如下，其中E，K和Δx, 分別為楊氏模量，彈性常數(shù)和形變量。</p><

11、p>　　F=KΔx=(3πEr44L1)Δx(1)</p><p>　　3 PDMS微懸臂梁陣列制作過程</p><p>　　圖2展示了采用復脫模方法制作微懸臂梁陣列的關鍵步驟。</p><p>　　3.1 第一步 (圖2 A-C) 是將設計好的掩模圖案通過光刻工藝轉(zhuǎn)移到光刻膠上。Tan 等［7］采用 SU-8 (Microchem, Newton, MA

12、) 負光膠，紫外曝光及顯影后，直徑 3 μm、高度11 μm、間距 9 μm的 SU-8 垂直懸臂梁陣列豎立在硅片上，作為復脫模微模具。由于光波長限制、毀壞性粘著及光膠回流等原因，采用接觸 I-line (波長365 nm) 紫外軟光刻標準工藝制作尺寸更小的結(jié)構(gòu)非常困難。du Roure等［8］and Li等［9］采用正光膠和深反應離子刻蝕 (DRIE) 工藝，在硅片上刻蝕出圓柱形孔陣列。采用這種工藝，du Roure 等制作出直徑 1

13、 μm、高度 5.2 μm、間距 3 μm的微懸臂梁陣列，這些尺寸指標非常突出。然而該方法有兩個缺點，首先，深反應離子刻蝕工藝對設備條件要求很高，對大部分研究人員而言，工藝制作費用非常昂貴；其次，用這種方法制作的微懸臂梁不完全是圓柱體，而在理論分析中一般采用圓柱體模型，若不經(jīng)校正直接使用，會導致測量誤差。Addae等［10］通過消除 SU-8 和掩模之間空氣間隙的不利影響，改進了接觸 I-line</p><p>

14、;　　3.2 第二步 (圖 2D-G) 是 PDMS 預聚物澆注，其中采用負光膠工藝需要二次澆注。首先，準備 PDMS (Sylgard 184, Dow-Corning)預聚物，充分混合PDMS 及其固化劑 (體積比: 10∶1) ，置入真空泵中抽氣20 min，PDMS 預聚物澆注到硅片上的 SU-8 懸臂梁陣列微模具上，放置在熱板上，65 ℃烘烤 12 h，將 PDMS 微模具從硅片剝離，氧離子處理 1 min，脫模劑蒸熏 12

15、 h，以利于后續(xù) PDMS 微懸臂梁陣列從 PDMS 微模具上分離。 然后，將PDMS 預聚物澆注到 PDMS 微模具中，置入真空泵抽氣 20 min，110 ℃烘烤20 h，從 PDMS 模上剝離 PDMS 微懸臂梁陣列。對于采用 DRIE 工藝直接硅片刻蝕生成的微模具，硅片先經(jīng)過硅烷化處理以易于后期脫模，然后將PDMS 預聚物澆注到硅片微模具，65℃烘烤 12 h，從硅模上剝離。</p><p>　　3.3

16、 第三步 (圖2 H-I) 是微懸臂梁頂端表面處理。PDMS 微懸臂梁陣列脫模后，氧離子表面處理使其親水。為進行下一步細胞實驗，采用微接觸印刷方法［12］ ，在PDMS 微懸臂梁陣列預定區(qū)域印刷上經(jīng)過熒光標記的細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)。Addae等［10］采用量子點標記技術可以在標準熒光顯微鏡下跟蹤微懸臂梁形變得到更精確的位移信息，使微分干涉差顯微鏡產(chǎn)生的懸臂梁頂端和細胞邊緣模糊問題最小化，并消除了信號衰減的時間依賴性。</p>

17、<p>　　力測量實驗的掃描電子顯微鏡 (SEM) 照片，采用同一標尺合成在一起以便于比較。Tan 等設計了 mPADs (microfabricated post-array-detectors)，直徑 3 μm、高度 11 μm、間距 9 μm，相對應每根懸臂梁可以達到 32 nN/μm 精度［7］。采用 DRIE 方法，du Roure 等制作出 μFSA (microdimensional force sensor a

18、rray) ，直徑 1 μm、高度 5.2 μm、間距 3 μm，深寬比接近 6，這是目前采用 PDMS 微懸臂梁陣列方法測量細胞牽引力所報道的最高深寬比值，力學測量精度可以達到 21.8nN/μm［8］。MFSA (micropost force sensor array) 由Li 等開發(fā)，直徑 2 μm、高度 6 μm、間距 4 μm，深寬比為3。結(jié)合圖像處理算法，MFSA 可以達到 40 nm 分辨率和 0.5 nN 力學靈敏度［

19、9］。BoN (bed of nails) 由 Addae-Mensah等研制，直徑 2 μm、高度 7 μm、間距 5 μm，深寬比為 3.</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　根據(jù)公式 (1) ，更高深寬比的微懸臂梁可以帶來更高的力學分辨率。實際上研究者們已經(jīng)嘗試提高工藝水平來制作更高深寬比的微懸臂梁陣列。比如直徑 1 μm，高度

20、20 μm，深寬比為 20 的微懸臂梁，當 PDMS 楊氏模量為 2 MPa 時，理論上對應精度為 0.04 nN/μm。如此高的力學分辨率確實不錯，但直覺告訴我們，過高的深寬比結(jié)構(gòu)會造成機械穩(wěn)定性問題。文獻［13-15］ 顯示幾何結(jié)構(gòu)一致的高深寬比 PDMS 懸臂梁會造成機械穩(wěn)定性問題，如側(cè)面倒塌和觸底倒塌。側(cè)面倒塌指多個微懸臂梁倒塌導致互相之間粘連，觸底倒塌指單個微懸臂梁倒塌與基底之間粘連?；?Hui 的倒塌模型理論［16］，高深

21、寬比結(jié)構(gòu)倒塌是由于自身重量所引起。但根據(jù)重力引起倒塌理論，目前尺寸條件下所有制作的 PDMS 微懸臂梁都不應該有穩(wěn)定性問題，但實驗結(jié)果事與愿違。文獻［17］指出，由于 PDMS 楊氏模量限制，在空氣中 PDMS 微懸臂梁的臨界深寬比在 6 左右。即使增加 PDMS 預聚體的烘烤時間或改變 PDMS 與固化劑的混合比率，楊氏模量不會發(fā)生顯著改變［18］。</p><p>　　我們發(fā)現(xiàn)在溶液中，PDMS微懸臂梁臨界深

22、寬比可以提高。實際上，在細胞實驗中，粘附有細胞的微懸臂梁是浸沒在培養(yǎng)基溶液中。因此，我們可以在溶液環(huán)境中制作微懸臂梁陣列以提高深寬比。我們設計了實驗在溶液環(huán)境下制作微懸臂梁陣列并將其浸沒在不同的溶液中，如乙醇和水中來考察其機械穩(wěn)定性。實驗表明，如果我們可以避免液體蒸發(fā)，打破微懸臂梁頂端液體表面張力平衡，微懸臂梁陣列可以保持直立穩(wěn)定。溶液表面能越低，臨界深寬比就越高，在水溶液中可以得到深寬比為 10 左右的微懸臂梁陣列。即使一些未知擾動，

23、如碰撞，流體表面張力等，不會導致微懸臂梁粘連倒塌。</p><p><b>　　5 結(jié)論</b></p><p>　　細胞牽引力細節(jié)知識對理解生物過程有著重要意義已成為共識。采用經(jīng)過表面處理的高深寬比 PDMS 微懸臂梁陣列作為傳感器，用來探測細胞牽引力，可以得到數(shù)十 nN/m 的分辨率。我們詳盡地綜述了采用 BioMEMS 工藝制作 PDMS 微懸臂梁矩陣的方法。

24、對測量原理和模型，制作技術流程，表面處理，細胞實驗等逐一詳細論述。BioMEMS 制造工藝發(fā)展迅速，雖然還有很多不足之處需要我們?nèi)ネ晟疲錇榧毎W測量領域提供了非常多的機會和方法值得我們?nèi)ヌ剿鳌?lt;/p><p>　　本工作由國家留學基金委支持，作者在此感謝北京理工大學生命信息實驗室和美國哥倫比亞大學生物微機電系統(tǒng)和微流控實驗室人員的幫助。</p><p><b>　　【參考文

25、獻】</b></p><p>　?。?］Choquet D, Felsenfeld D P and Sheetz M P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages ［J］. Cell, 1997, 88: 39-48.</p><p>　?。?］We

26、isenhorn AL, Khorsandi M, Kasas S, et al. Deformation and height anomaly of soft surfaces studied with an AFM ［J］. Nanotechnology, 1993, 4: 106-113.</p><p>　?。?］Chien S, Sung KL, Skalak R, et al. Theoretical

27、 and experimental studies on viscoelastic properties of erythrocyte membrane ［J］. Biophys J, 1978, 24: 463-487.</p><p>　?。?］Harris AK, Wild P, Stopak D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study

28、of cell locomotion ［J］. Science, 1980, 208: 177-179.</p><p>　?。?］Yang S, Saif T. Micromachined force sensors for the study of cell mechanics ［J］. Rev Sci Instrum, 2005, 76: 044301-044308.</p><p>

29、;　?。?］Butler JP, Tolic-Norrelykke IM, Fabry B, et al. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings ［J］. Am J Physiol Cell Physiol, 2002, 282: C595-C605.</p><p>　　［7］Tan

30、J L, Tien J, Pirone D M, et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force ［J］. PNAS, 2003, 100: 1484-1489.</p><p>　?。?］du Roure O, Saez A, Buguin A, et al. Force mapping i

31、n epithelial cell migration ［J］. PNAS, 2005, 102: 2390-2395.</p><p>　　［9］Li B, Xie L K. Development of micropost force sensor array with culture experiments for determination of cell traction forces ［J］. Cel

32、l Motility and the Cytoskeleton, 2007, 64: 509-518.</p><p>　　［10］Addae-Mensah K A, Kassebaum N J, Bowers, et al. A flexible, quantum dot-labeled cantilever post array for studying cellular microforces ［J］. S

33、ensors and Actuators a-Physical, 2007, 136: 385-397.</p><p>　　［11］Crandall S H. An introduction to the mechanics of solids ［M］.New York：McGraw-Hill,1978：511-576.</p><p>　?。?2］Tan J L, Tien J and

34、 Chen C S. Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers ［J］. Langmuir, 2002, 18: 519-523.</p><p>　?。?3］Geim A K, Dubonos S V, Grigorieva I V, et al. Microfabricated adhesive mimicking

35、 gecko foot-hair ［J］. Nature Materials, 2003, 2: 461-463.</p><p>　?。?4］Glassmaker N J, Jagota A, Hui, et al. Design of biomimetic fibrillar interfaces: 1. Making contact ［J］. Journal of the Royal Society Int

36、erface, 2004, 1: 23-33.</p><p>　?。?5］Sharp K G, Blackman G S, Glassmaker N J, et al. Effect of stamp deformation on the quality of microcontact printing: theory and experiment ［J］. Langmuir, 2004, 20: 6430-6

37、438.</p><p>　?。?6］Hui C Y, Jagota A, Lin Y Y, et al. Constraints on microcontact printing imposed by stamp deformation ［J］. Langmuir, 2002, 18: 1394-1407.</p><p>　?。?7］Roca-Cusachs P, Rico F, Ma

38、rtinez E, et al. Stability of microfabricated high aspect ratio structures in poly(dimethylsiloxane) ［J］. Langmuir, 2005, 21: 5542-5548.</p><p>　?。?8］Gray D S, Tien J and Chen C S. Repositioning of cells by