鯊魚肉酶解液鈣螯合物的抗氧化抗菌活性分析【開題報告+文獻綜述+畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　食品質量與安全</b></p><p>　　鯊魚肉酶解蛋白鈣化螯合物抗菌性和抗氧化性分析</p><p>　　一、選題的背景與意義</p>

2、;<p>　　鯊魚肉是魚翅加工的下腳料，隨著魚翅加工業(yè)的迅速發(fā)展，鯊魚肉資源豐富。目前對鯊魚肉的研究，國內主要集中在對其產品加工工藝方面的研究，利用多是將其加工成寵物食品或魚糜制品，對其深度加工及其生理活性的研究不多，這大大限制了鯊魚肉的應用范圍。國外的研究多集中在鯊魚體內金屬的累積效應，也有涉及到生理活性方面的研究，如Bou等通過腸道蛋白酶對星鯊肉進行酶解，對其酶解產物的抗氧化和自由基清除能力進行研究。</p>

3、;<p>　　鯊魚肉有較高含量的蛋白質，可以將其水解成富含多肽和氨基酸的水解液，并進一步經過金屬離子如鈣、鐵、鋅等修飾，得到鯊魚肉酶解蛋白金屬螯合物，并分析其抗氧化和抗菌活性，為制備活性物質提供理論基礎，以充分利用鯊魚肉資源。</p><p>　　二、研究的基本內容與擬解決的主要問題：</p><p><b>　　研究基本內容：</b></p>

4、;<p>　　分離提純優(yōu)化條件下制備得到的鯊魚肉酶解蛋白螯合物，并進一步研究其抗氧化和抗菌活性，探討其結構與活性之間關系。</p><p><b>　　擬解決的主要問題：</b></p><p>　　確定螯合物的抗氧化活性和抗菌活性</p><p>　　三、研究的方法與技術路線：</p><p>　　抗氧化

5、性研究：以DPPH、硫代巴比妥酸法等，用經過不同濃度有機溶劑分級沉淀獲得的不同組分的螯合物來進行測定和比較。</p><p>　　抗菌性分析：采用牛津杯雙層培養(yǎng)法，用經過不同濃度有機溶劑分級沉淀獲得的不同組分的螯合來進行實驗，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等作為對象，以抑菌圈為評價指標。</p><p>　　四、研究的總體安排與進度：</p><p>　　2010.10

6、.8——2010.12.15</p><p>　　查詢與論文有關的資料、撰寫試驗計劃、熟悉基本的實驗操作</p><p>　　2011.12.16――2011.4.20</p><p>　　對螯合物進行抗菌性和抗氧化性研究</p><p>　　2011.4.21――2011.5.10</p><p>　　整理數(shù)據(jù)，撰寫

7、論文，論文答辯</p><p><b>　　五、主要參考文獻：</b></p><p>　　[1]胡奇?zhèn)?金屬螯合物的營養(yǎng)作用[J].湖北畜牧獸醫(yī)，l994，2</p><p>　　[2]徐清海,明霞.由雞羽毛制備復合氨基酸鐵復合物方法田[J].沈陽農業(yè)大學學報,2001,32(1):51-53.</p><p>　　[

8、3]Ashmead H D．Unlocking reproductive potential in the sow with amino acid chelated elements．Proceedings of the anaporcsympo-sium，Spain，1996.</p><p>　　[4] Found M T．The Physiochemical role of chelated mininer

9、al in mailintaining optimal body biological functions[J],Journal of Applied Nutrition,1974,28:5.</p><p>　　[5] Webb K E,J,C.Mattbews,D.B.Dirianzo. Peptid absorption:A review of current concepts and future Per

10、spective[J], J．Anim．Sci,1992,70:3248-3257.</p><p>　　[6] Bronk J R,N.Lister,R.A.Helliwell. Stereospecificity ofdipeptide transport in rat small intotine in vitro[J].J.Physiol,1993,467:189.</p><p>

11、;　　[7]劉安軍,王維君,曹東旭等.膠原蛋白多肽-鉻(Ⅲ)螯合物對小鼠肝臟SOD表達的影響[J].食品研究與開發(fā),2007(12):22-25.</p><p>　　[8] Dhuwad SD，Guadsi KB，Goudar IR．et a1．．IndianJ．Chem．Sect A：Inorg．Bio-Inorg．Phs．，1995，34A(1)：38</p><p>　　[9] 張

12、建榮,馬儷珍,甄潤英等.鯰魚骨酶解產物抑菌活性的酶解工藝優(yōu)化[J].食品科技,2008,8:173-176.</p><p>　　[10][11]楊燊，鄧尚貴，秦小明.低值魚蛋白多肽-鈣螯合物的制備和抗氧化、抗菌活性研究[J].食品科學,2008(1):202-206.</p><p>　　[12]夏松養(yǎng),謝 超,霍建聰?shù)? 魚蛋白酶水解物的鈣螯合修飾及其功能活性[J]. 水產學報, 20

13、08,5.03—0471—07</p><p>　　[13]AISEL H．Overview on n1ilk protein-derived peptides[J]．Int Dairy</p><p>　　Journal，1998(8)：363—373．CLARE D A，SWAIS D H E．Bioacfive milk peptides：a prospectus</p>

14、<p>　　[J]．J Dairy Sci，2000，83：1187—1195．</p><p>　　[14]何寧，王昌祿，顧曉波，等．杯碟法檢測乳酸菌素活性優(yōu)化條件的研究[J]．天津輕工業(yè)學院學報，1999，2：l8—20．</p><p>　　[15] 卞偉，楊頻．兩種新的4，4 一聯(lián)噻唑衍生物的合成、表征及抗菌性研究[J]．山西大學學報(自然科學版)，2000，23(3

15、)：231—233．</p><p>　　[16]吳旭彤．樣品的體外抑菌實驗[J]．中華現(xiàn)代中西醫(yī)雜志，2004，(1)：15—17．</p><p>　　[17]王麗杰，張東杰．平貝總堿體外抗菌活性研究【J】_中國釀造，2009(3)：90．92．</p><p>　　[18][19]Rathee，J．S．，Hassarajani，S．A．，Chattopadhy

16、ay S．Antioxidant activity</p><p>　　of Mammea longifolia bud extracts[J]．Food Chemistry，2006(99)：436～443．</p><p>　　[20]Mathew，S．，Abraham，T．E．In vitro antioxidant activity and scavenging</p>

17、<p>　　effects of Cinnamomum verum leaf extract assayed by different metho—dologies[J]．Food and Chemical Toxicology，2006( 44)：198～206．</p><p>　　[21] 金嗚，蔡亞欣，李金榮等．鄰二氮菲．Fe 氧化法檢測H202／Fe 產生的羥自由基[J]．生物化學與生物物

18、理進展，1996，23(6)：553-555．</p><p>　　[22]馬勇，邵立新．人參花蕾提取液清除羥基自由基作用研究[J]．食品科學，2008，29(10)：101—104．</p><p>　　[23]Sakanaka,S．Ishihara，Y． Comparison of antioxidant properties of persimmon vinegar and some

19、 other commercial vinegars in radical—scavenging assays and on lipid oxidation in tuna homogenates[J]．Food Chemistry，2008(107)：739～744</p><p>　　[24]蕭華山，何文錦，傅文慶，曹紅云，范子南．一種用分光光度計檢測氧自由基的新方法[J]．生</p><

20、p>　　物化學與生物物理進展，1999，26(2)：l80～ l82．</p><p>　　[25]鐘飛，王曉春，林麗．葛根體外清除氧自由基作用的研究[J]．湖南中醫(yī)學院學報，2004，24(2)：17～19</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　食品質量與安全</b>&l

21、t;/p><p>　　蛋白降解物螯合物活性的研究</p><p>　　[摘要] 螯合物是由中心離子和多齒配體結合而成的具有環(huán)狀結構的配合物，其制備需考慮物料配比等各種因素。它具有多種生理功能以及一定的抗菌性和抗氧化性。本文主要介紹蛋白降解螯合物的制備方法及特性的研究，其中主要詳述了有關其抗氧化性和抗菌性的研究。</p><p>　　[關鍵詞]：蛋白降解螯合物 制備 抗

22、氧化性 抗菌性</p><p><b>　　1 蛋白降解螯合物</b></p><p>　　鰲合物在上世紀70年代就開始研究，最初是由美國Albion實驗室進行，以動植物蛋白和鐵元素為原料合成了蛋白鐵(IronProteinase)復合物。國內的蛋白酶解物金屬離子螯合研究開始于上個世紀九十年代，關于魚肉的酶解物金屬離子螯合研究在近幾年才逐漸出現(xiàn)。</p>

23、<p><b>　　1.1螯合物的定義</b></p><p>　　“螯合物”【1】通常專指金屬與二個氨基酸或多個氨基酸通過較牢固的化學鍵(配位鍵和離子鍵)形成的雜環(huán)(五環(huán)或六環(huán))結構，整個分子結構呈中性，也有人稱其為肽螯合，能借助原有的小肽吸收機制被機體吸收，快速，高效，低耗能，不易飽和。在眾多的有機礦物質當中，二肽螯合物是最理想、最高效、效果也最好的有機物。</p&g

24、t;<p>　　1．2 蛋白降解物螯合物的制備</p><p>　　蛋白降解物金屬螯合物的制備一般分為如下幾個步驟：蛋白降解物制備→加入金屬離子→調整反映環(huán)境→螯合→分離提純【2】。在制備時，需考慮到時間溫度、DH、PH、物料比等因素。</p><p>　　2 蛋白降解物螯合物功能活性的研究</p><p>　　目前，對肽和氨基酸螯合金屬離子的作用模式

25、尚不清楚．被研究者較為接受的是氨基酸或肽的吸收機制。Ashmead【3】等證明，氨基酸螯合金屬離子的吸收是利用氨基酸或小肽的吸收機制，不同于小腸中普通金屬的吸收機制。Found【4】研究表明，位于具有五元環(huán)或六元環(huán)中心的金屬離子可以直接通過小腸絨毛刷狀緣，以胞飲的形式吸收。此理論的根據(jù)是金屬離子以共價鍵和離子鍵與氨基酸的配位體鍵合，被保護在復合物的核心，避免了一些理化因子的攻擊，而且金屬螯合物被腸粘膜吸收，使得所攜帶的金屬離子得到更有效

26、的吸收。Webb【5】等的研究表明，對所有動物來說，氨基酸以肽的形式吸收和以游離氨基酸的形式吸收同樣重要，甚至更重要。Bronk【6】等證明小肽能完整地被吸收，通過腸粘膜細胞進入體循環(huán)。</p><p><b>　　2.1 生理功能</b></p><p>　　劉安軍【7】等通過肽質量指紋圖譜對差異蛋白的分析和無SDS-丙烯酰胺電泳的抗氧化染色研究表明膠原蛋白多肽-鉻

27、(Ⅲ)螯合物可顯著提高小鼠肝臟內SOD表達量，從而證明膠原蛋白多肽-鉻(Ⅲ)螯合物可以清除小鼠體內大量的自由基，進而證明膠原蛋白多肽-鉻(Ⅲ)螯合物可以對肝臟的損傷進行保護。Dhumwad【8】等發(fā)現(xiàn)某些氨基酸堿金屬螯合體對老鼠肌肉內Wslker206癌有抑制作用。</p><p><b>　　2.2 抗菌性</b></p><p>　　有許多研究表明一些小肽具有廣譜

28、殺菌作用，相對分子量較小，具有熱穩(wěn)定、水溶性好等優(yōu)點。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，食物蛋白經酶解也有可能產生出有效的抗菌肽。這方面的研究多以由乳蛋白產生的抗菌肽，以水產原料的報道較少。張建榮【9】等對鯰魚骨酶解產物的抑菌活性進行了研究，其以大腸桿菌、枯草桿菌和藤黃色葡萄球菌為供試菌種，以抑菌性為指標對酶解條件進行了優(yōu)化。楊燊【10】在抗菌性實驗中采用牛津杯雙層平板法對魚蛋白酶解的鈣螯合物進行研究，發(fā)現(xiàn)螯合反應后加80%無水乙醇分級沉淀得到的物質對

29、枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌均有較好的抗菌效果，活性肽及其螯合物抑菌作用均不明顯，活性肽樣品無抑菌圈出現(xiàn)。</p><p><b>　　2.3 抗氧化性</b></p><p>　　楊燊【11】等以南海低值魚蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶和風味酶的復合酶水解制備多肽復合物，對及價值魚類的蛋白多肽的鈣螯合物的研究，研究表明出鈣螯合物都具有一定的抗氧化作用，螯合反應后未經過無

30、水乙醇分級沉淀得到的物質抗氧化作用最強，其抗氧化效果達到生育酚的94.43%。</p><p>　　2.4蛋白降解物螯合物的分級產物的功能性區(qū)別</p><p>　　夏松楊【12】等以低值魚蛋白為原料通過復合酶水解法和鈣修飾法獲得了蛋白質酶水解物的修飾產物并對其功能活性進行了初步研究，分析了三種螯合組分的抗氧化活性與抗菌性，分別是水不溶物、50%乙醇不溶物和80%乙醇不溶物，結果發(fā)現(xiàn)組分水

31、不溶物具有最高的抗氧化活性，且高達未螯合的水解物抗氧化活性的1.4倍，結果同樣為a- 生育酚的94％，80%無水乙醇不溶物具有較高的抗大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的活性。</p><p><b>　　3 抗菌性的研究</b></p><p>　　據(jù)報道【13】螯合物的肽分子可能和細菌細胞膜受體蛋白結合，改變細胞質膜通透性，造成膜結構破壞，引起膜內水溶性物質大

32、量滲出，從而導致細菌死亡。</p><p>　　3.1觀察抑菌圈 在做抗菌性研究時，大多實驗通過抑菌圈來反映某物質抗菌能力的強弱。其中主要有牛津杯雙層半板法【14】。其主要過程主要為在無菌平皿中倒入10ml加熱融化的2％ 瓊脂，待其充分冷卻凝固后，放入已滅菌的牛津杯數(shù)個，并按一定次序排放整齊。將分裝于大試管中的15ml固體檢測培養(yǎng)基融化后冷卻全50℃左右，加入10 g個／ml指示菌液1ml，迅速混合均勻，倒入半

33、皿。冷卻后，用無菌鑷子取出牛津杯，作為活性肽螯合物活性檢測平板。用0．1ml吸管吸取1O0～200 u1待測樣品，以無菌操作加入到檢測平板圓孔內，37℃ 培養(yǎng)1 5h，觀察并測定抑菌圈直徑(mm)。 此外還有紙片法【15】，觀察經受試液浸濕過的濾紙片周圍實驗菌生長情況，通過抑菌圈大小判斷受試藥品的抑菌作用，記錄抑菌直徑，以符號?0’、“+”、“++”表示抑菌活度，“O”表示無抑菌作用，“+”表示可觀察到抑菌圈，“++表示有7mm左右的抑

34、菌圈．</p><p>　　3.2測最低抑菌濃度(MIC)【16】 用LB瓊脂培養(yǎng)基以倍比稀釋法配制成l0個濃度的藥物梯度，移人平皿，兩種細菌每組隨機選取4株。用生理鹽水將大腸桿菌和葡萄球菌菌株以鏡檢計數(shù)方式配成1xl0 cfu·mL 的菌懸液，分別接種于含有不同藥物梯度的LB瓊脂培養(yǎng)基中；另做不含藥物的培養(yǎng)基接種菌懸液，作為生長菌的空白對照。樣品于37~C培養(yǎng)，36h觀察細菌生長情況，測定菌種的M

35、IC。</p><p>　　3.3 測最小殺菌濃度(MBC)【17】 以倍比稀釋法稀釋所測樣品后，接種菌懸液，另作空白對照，樣品置37℃培養(yǎng)， 放置不同時間觀察細菌生長情況。一般來說同一菌種測定4株菌的MBC50和MBC90，結果取平均值。每個試驗組做4個重復，最后取各組的平均值進行分析。</p><p><b>　　4 抗氧化性的研究</b></p>

36、<p>　　抗氧化性的研究方法主要有TBA（硫代巴比妥酸）法、抗油脂過氧化(LPO)法、自由基清除指標法等。</p><p>　　4.1 TBA法 這是基于不飽和脂肪酸通過自由基反應， 形成過氧化自由基，而氧化生成環(huán)氧化物，后者分解生成丙二醛，丙二醛與TBA作用生成TBA染料，最大吸收波長為535nm。</p><p>　　4.2抗油脂過氧化(LPO)法 生物體內細胞膜的

37、流動性和滲透性由其磷脂等成分保證，過多的自由基襲擊、油脂過氧化會導致細胞死亡。因此，抗氧化劑對脂類氧化的抑制作用也顯得至關重要。Rathee等【18】 用老鼠肝臟線粒體作底物，一植物芽體(nagkesar)提取物抗脂質過氧化能力為： 生育酚>水一乙醇提取物>甲醇提取物。</p><p>　　4.3自由基清除方法 自由基是含有未成對電子的原子、原子團或分子?；钚匝跞绯蹶庪x子、羥自由基和過氧化氫由正常

38、的生理過程和各種外在因素造成。它們一旦產生，就會引發(fā)油脂過氧化，與人體很多疾病相關。自由基損傷生物大分子，是衰老衍變的啟動。因此，自由基清除能力的測定對生物研究非常重要。</p><p>　　4．3．1 DPPH·(2，2一二苯代苦味肼基)ABTS+·(2，2’一連氮.(一3-乙基苯并噻唑啉磺酸基)清除。 大部分自由基性質活潑，壽命非常短，但DPPH·和ABTS+·例外，

39、是兩種穩(wěn)定的自由基。DPPH·乙醇溶液呈深紫色，在517nm處有一強吸收。若有單電子配對，則吸收消失，其褪色程度與接受的電子數(shù)成定量關系，因而可用分光光度法進行定量分析。Rathee等【19】 用DPPH法顯示一植物芽體(nagkesar)甲醇提取物的清除能力(IC508．33 4,-0．391g／ml>優(yōu)于水一乙醇提取物的清除能力。而ABTSfl,被各種氧化劑生成藍綠色的自由基陽離，而抗氧化劑的存在又可使ABTS+&#

40、183;還原，顏色褪去。特征吸收峰下比色，清除能力用TEAC(當量抗氧化能力)表示。Mathew等【20】 用過硫酸鉀氧化羥自由基，測玉桂葉對ABTS+·的清除能力，得沒食子酸>抗壞血酸>BHT>玉桂葉。</p><p>　　4．3.2 羥自由基(OH·)的清除。 OH·是體內最活潑的活性氧，也是已知的對生物分子破壞能力最強的自由基之一。運用鄰二氮菲法【21】，

41、H O 與二價鐵離子混合后產生·OH。· OH具有很高的反應活性，存活時間短。如果加入抗氧化劑，將會有更多的Fe 存留于溶液中，而使吸光度增加，從而可用計算出的羥基自由基清除率表示出抗氧化劑的活性。</p><p>　　也可以運用水楊酸法【22】測定。在反應體系中加人水楊酸后能有效地捕捉·OH，并產生紫紅色產物，該產物在510nm處有強吸收，若加入自由基清除劑，便會與水楊酸競爭，從而

42、使有色產物的生成量減少，采用固定時間法，在510nm處測定被測物反應的吸光度，并與空白溶液比較，便能確定被測物對其的清除作用．</p><p>　　4.4 超氧陰離子清除</p><p>　　4．4．1 氯化硝基四氮唑藍(NBT)法 黃嘌呤一黃嘌呤氧化酶體系產生02-· ， NBT被02-· 還原成藍紫色的formazane。比色formazane間接測定02-。Sa

43、kanaka等【23】 用此法對幾種醋進行抗氧化性測定，它們都有清除能力，且柿子醋和米醋的清除能力比加工過的米醋和蘋果醋的要高。</p><p>　　4.4.2過硫酸銨／N，N，N’，N’一四甲基乙二胺(AP—TEMED)法 此法是通過過硫酸銨／N，N，N’，N’一四甲基乙二胺體系產生氧自由基，然后可采用不同的方法測定。反應機理為02-與羥胺溶液反應生成N02- ，N02-經對氨基苯磺酸和萘胺顯色在530附近有

44、專一吸收峰，通過檢測02-間接檢測02-。此法由蕭華山等【24】 建立，并驗證了抗壞血酸對0j·的清除作用呈明顯量效關系。</p><p>　　4．4.3 鄰苯三酚(MTT)法 鄰苯三酚在堿性條件下自動氧化，不斷釋放出02-，02-又可進一步促進自氧化。在鄰苯三酚自氧化30～40s后，中間物積累濃度與時間呈線性關系，一般線性時間可維持4min左右，可求得自氧化速率來表征02-的清除能力。鐘飛等【25】

45、 用此法測定了葛根體外清除02-清除能力。</p><p><b>　　5 展望</b></p><p>　　微量元素氨基酸螯合物以其高的生物利用率，低劑量高效地滿足動物對微量元素的營養(yǎng)需求，這不僅節(jié)約了生產性資源，對農業(yè)生態(tài)環(huán)境的保護有重要的作用保障畜產品食品安全問題，對國家提倡的飼料安全，廣大消費者關注的“放心肉”工程具有廣泛的意義。魚肉經酶作用水解后，功能和品質

46、可得到提高，再經過金屬離子螯合如鈣、鐵、鋅等，不僅能提升其品質與功能性而且還會體現(xiàn)出新的有益的功能活性，通過研究其抗氧化性與抗菌性，可以考慮制成一種良好的食品添加劑，有著不錯的市場前景。</p><p>　　然而，目前氨基酸微量元素螯合物的各種產品其生產工藝相對來說還較復雜，生產成本比較高，作用模式不夠深入以及其它一些原因使產品在生產中的廣泛應用受到一定的限制。</p><p><b

47、>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]胡奇?zhèn)?金屬螯合物的營養(yǎng)作用[J].湖北畜牧獸醫(yī)，l994，2</p><p>　　[2]徐清海,明霞.由雞羽毛制備復合氨基酸鐵復合物方法田[J].沈陽農業(yè)大學學報,2001,32(1):51-53.</p><p>　　[3]Ashmead H D．Unlocking reproductive p

48、otential in the sow with amino acid chelated elements．Proceedings of the anaporcsympo-sium，Spain，1996.</p><p>　　[4] Found M T．The Physiochemical role of chelated minineral in mailintaining optimal body biolo

49、gical functions[J],Journal of Applied Nutrition,1974,28:5.</p><p>　　[5] Webb K E,J,C.Mattbews,D.B.Dirianzo. Peptid absorption:A review of current concepts and future Perspective[J], J．Anim．Sci,1992,70:3248-3

50、257.</p><p>　　[6] Bronk J R,N.Lister,R.A.Helliwell. Stereospecificity ofdipeptide transport in rat small intotine in vitro[J].J.Physiol,1993,467:189.</p><p>　　[7]劉安軍,王維君,曹東旭等.膠原蛋白多肽-鉻(Ⅲ)螯合物對小鼠肝臟

51、SOD表達的影響[J].食品研究與開發(fā),2007(12):22-25.</p><p>　　[8] Dhuwad SD，Guadsi KB，Goudar IR．et a1．．IndianJ．Chem．Sect A：Inorg．Bio-Inorg．Phs．，1995，34A(1)：38</p><p>　　[9] 張建榮,馬儷珍,甄潤英等.鯰魚骨酶解產物抑菌活性的酶解工藝優(yōu)化[J].食品科技

52、,2008,8:173-176.</p><p>　　[10][11]楊燊，鄧尚貴，秦小明.低值魚蛋白多肽-鈣螯合物的制備和抗氧化、抗菌活性研究[J].食品科學,2008(1):202-206.</p><p>　　[12]夏松養(yǎng),謝 超,霍建聰?shù)? 魚蛋白酶水解物的鈣螯合修飾及其功能活性[J]. 水產學報, 2008,5.03—0471—07</p><p>　　

53、[13]AISEL H．Overview on n1ilk protein-derived peptides[J]．Int Dairy</p><p>　　Journal，1998(8)：363—373．CLARE D A，SWAIS D H E．Bioacfive milk peptides：a prospectus</p><p>　　[J]．J Dairy Sci，2000，83：1

54、187—1195．</p><p>　　[14]何寧，王昌祿，顧曉波，等．杯碟法檢測乳酸菌素活性優(yōu)化條件的研究[J]．天津輕工業(yè)學院學報，1999，2：l8—20．</p><p>　　[15] 卞偉，楊頻．兩種新的4，4 一聯(lián)噻唑衍生物的合成、表征及抗菌性研究[J]．山西大學學報(自然科學版)，2000，23(3)：231—233．</p><p>　　[16]吳

55、旭彤．樣品的體外抑菌實驗[J]．中華現(xiàn)代中西醫(yī)雜志，2004，(1)：15—17．</p><p>　　[17]王麗杰，張東杰．平貝總堿體外抗菌活性研究【J】_中國釀造，2009(3)：90．92．</p><p>　　[18][19]Rathee，J．S．，Hassarajani，S．A．，Chattopadhyay S．Antioxidant activity</p>&

56、lt;p>　　of Mammea longifolia bud extracts[J]．Food Chemistry，2006(99)：436～443．</p><p>　　[20]Mathew，S．，Abraham，T．E．In vitro antioxidant activity and scavenging</p><p>　　effects of Cinnamomum ver

57、um leaf extract assayed by different metho—dologies[J]．Food and Chemical Toxicology，2006( 44)：198～206．</p><p>　　[21] 金嗚，蔡亞欣，李金榮等．鄰二氮菲．Fe 氧化法檢測H202／Fe 產生的羥自由基[J]．生物化學與生物物理進展，1996，23(6)：553-555．</p><

58、;p>　　[22]馬勇，邵立新．人參花蕾提取液清除羥基自由基作用研究[J]．食品科學，2008，29(10)：101—104．</p><p>　　[23]Sakanaka,S．Ishihara，Y． Comparison of antioxidant properties of persimmon vinegar and some other commercial vinegars in radical—

59、scavenging assays and on lipid oxidation in tuna homogenates[J]．Food Chemistry，2008(107)：739～744</p><p>　　[24]蕭華山，何文錦，傅文慶，曹紅云，范子南．一種用分光光度計檢測氧自由基的新方法[J]．生物化學與生物物理進展，1999，26(2)：l80～ l82．</p><p>　　

60、[25]鐘飛，王曉春，林麗．葛根體外清除氧自由基作用的研究[J]．湖南中醫(yī)學院學報，2004，24(2)：17～19</p><p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　鯊魚肉酶解液鈣螯合物的抗氧化抗菌活性分析</p><p>

61、<b>　　目錄</b></p><p><b>　　1引言1</b></p><p><b>　　2材料與方法1</b></p><p>　　2.1 主要材料1</p><p>　　2.2 主要儀器2</p><p><b>　　2.

62、3 試劑2</b></p><p><b>　　2.4 方法2</b></p><p>　　2.4.1 鯊魚肉酶解液鈣螯合物的分級沉淀2</p><p>　　2.4.2 鈣螯合物抗氧化活性的測定2</p><p>　　2.4.3 鈣螯合物抗菌性的測定3</p><p>　　2

63、.5 數(shù)據(jù)處理4</p><p><b>　　3結果與討論4</b></p><p>　　3.1 鯊魚肉酶解液鈣螯合物各級乙醇沉淀產物的得率與性質4</p><p>　　3.2 酶解液鈣螯合物的抗氧化性分析4</p><p>　　3.2.2 螯合物的清除OH·自由基能力5</p><

64、;p>　　3.2.3 螯合物的DPPH·清除能力6</p><p>　　3.2.4 螯合物清除O2-自由基能力7</p><p>　　3.3 鈣螯合物的抗菌性測定8</p><p><b>　　4結論9</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p>

65、<b>　　參考文獻10</b></p><p><b>　　附錄11</b></p><p>　　摘要：以鯊魚肉酶解液為原料，以CaCl2為鈣源進行螯合，利用無水乙醇分級沉淀螯合物，同時測定各級螯合物的抗氧化與抗菌活性。結果顯示：1）水不溶物、50%乙醇不溶物、80%乙醇不溶物得率分別為：0.85%、0.86%、1.03%。2）80%乙醇不

66、溶物的抗氧化性效果最好，其清除DPPH·、O2-自由基、OH·自由基的IC50值分別為7.318mg.mL-1、23.22mg.mL-1、5.60mg.mL-1，TBA實驗顯示其抗氧化效果與α-生育酚接近；水不溶物與50%乙醇不溶物均具有一定的抗氧化性效果，但弱于80%乙醇不溶物。3）80%乙醇不溶物的抗菌效果稍強于50%乙醇不溶物，隨著螯合物濃度的提高，抗菌效果增強。</p><p>　　關

67、鍵詞：鯊魚肉；酶解液；鈣螯合物；抗氧化；抗菌</p><p>　　Abstract: The chelate was precipitated fractionally by alcohol, which is made from Shark meat hydrolyzate and Calcium chloride. Simultaneously, antimicrobial and antioxidant a

68、ctivity were analysed at all levels of chelation products. The results were as follows: 1) The yeild of water insoluble, 50% alcohol insoluble and 80% alcohol insoluble products were 0.85%, 0.86%, 1.03% , respectively, w

69、hich is relative to wet meat. 2）80% alcohol insoluble showed the best antioxidant activity, it’s IC50 of </p><p>　　Key words: shark meat; hydrolyzate; calcium chelate; antibacterial; antioxidan1引言</p>

70、<p>　　“海中霸王”鯊魚廣泛分布于印度洋、太平洋和大西洋，為全球性魚類，在我國南海、東海和黃渤海均有分布。我國鯊魚捕撈量較大，年產量近2萬噸，漁獲產量以東海區(qū)南部最高，約占全國產量的44%。而目前對鯊魚的利用主要局限于價值較高、占鯊魚總重15%的魚鰭上，其加工下腳料尤其是產量巨大的鯊魚肉并未得到很好的利用。研究表明，鯊魚肉營養(yǎng)豐富，含豐富的不飽和脂肪酸和多種礦物質，其蛋白質的氨基酸比值與人體肌肉蛋白成分非常接近，其吸收利

71、用率高，但鯊魚肉質粗，加上含有較多的尿素，感官上并不令人滿意，直接食用往往受到限制。</p><p>　　對鯊魚肉的研究，國內主要集中在對其產品加工工藝方面，對其深度加工及其生理活性的研究較少。如農紹莊[1]等研究了鯊魚肉魚腸的制作工藝；袁秋萍[2]對鯊魚肉松保健食品進行了研制；謝榮輝[3]以鯊魚肉為原料制作貓食寵物食品，并對其中添加的抗氧化劑進行篩選。目前對鯊魚肉的利用多是將其加工成寵物食品或肉腸、魚松制品，這

72、大大限制了鯊魚肉的應用范圍。</p><p>　　金屬螯合物是由中心離子和多齒配體結合而成的具有環(huán)狀結構的配合物。在螯合物的結構中，有一個或多個多齒配體提供多對電子與中心體形成配位鍵[4]。金屬螯合物的研究始于上世紀70年代，最初由美國Albion實驗室進行，以動植物蛋白和鐵元素為原料合成了鐵蛋白復合物。一般認為金屬離子被氨基酸或多肽鰲合后，能生成具有穩(wěn)定結構形態(tài)的金屬螯合物，有機物中的金屬離子在配位體氨基酸的保

73、護下，可有效抵御與其它離子生成難溶的無機鹽，克服了無機鹽的一些缺點，抑制了礦物質之間的相互影響，大大提高生物對于各種金屬元素的吸收利用率。由于金屬螯合物具有良好的利用率和適口性，加上低廉的成本，已被廣泛的應用在食品和飼料行業(yè)，尤其是在保健品中。</p><p>　　國內的蛋白酶解物金屬離子螯合研究開始于上世紀90年代，而魚肉蛋白酶解物的金屬離子螯合研究在近幾年才逐漸出現(xiàn)。目前對蛋白降解物金屬離子螯合物的生物學功能

74、研究報道較多，如劉安軍[5]等研究表明膠原蛋白多肽-鉻(Ⅲ)螯合物可顯著提高小鼠肝臟內超氧化物歧化酶（SOD）的表達量，證明膠原蛋白多肽-鉻(Ⅲ)螯合物可以清除小鼠體內大量的自由基，對肝臟的損傷進行保護；楊燊等[6]以南海低值魚蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶和風味酶的復合酶水解制備多肽復合物，并進一步研究魚肉蛋白多肽的鈣螯合物，研究表明該鈣螯合物具有一定的抗氧化作用。</p><p>　　魚肉經酶作用水解后，功能和品

75、質可得到提高，再經過金屬離子如鈣、鐵、鋅等螯合，不僅能提升其品質與功能性，而且有可能體現(xiàn)出新的有益活性。目前利用鯊魚肉酶解液為原料，制備金屬螯合物，并進一步研究其生理活性的研究國內外未見報道，本實驗室在酶解鯊魚肉，優(yōu)化酶解液鈣螯合條件的基礎上，得到了鯊魚肉酶解液鈣螯合物。本文利用無水乙醇作為萃取劑，對優(yōu)化條件下制備的鯊魚肉酶解液鈣螯合物進行分級沉淀，得到水不溶物、50%乙醇不溶物、80%乙醇不溶物三個螯合物組分，以硫代巴比妥酸法（TBA

76、法）、自由基清除率等分別測定螯合物的抗氧化活性，同時以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌為試驗菌，以抑菌圈大小為指標分析其抗菌活性，旨為鯊魚肉的開發(fā)、鯊魚肉酶解液鈣螯合物的進一步利用提供理論依據(jù)。</p><p><b>　　2材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 主要材料</b></p><p>　　鯊

77、魚肉：由溫州某水產開發(fā)有限公司提供，為魚翅加工的副產品。</p><p>　　鯊魚肉酶解液鈣螯合物：由本實驗室自制。</p><p>　　試驗菌種：大腸桿菌Esoherichia coli、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis均由本院微生物實驗室提供。</p><p><b>　　2.2

78、主要儀器</b></p><p><b>　　2.3 試劑</b></p><p>　　名稱 純度 生產企業(yè)</p><p>　　木瓜蛋白酶（酶活1.11105U/g） 食品級 廣西南寧龐博生物公司&l

79、t;/p><p>　　鄰菲羅啉 分析純 天津市博迪化工有限公司</p><p>　　過氧化氫 分析純 杭州高晶精細化工有限公司</p><p>　　磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 分析純

80、 汕頭市金砂化工廠</p><p>　　硫酸亞鐵 分析純 四達表面處理材料廠</p><p>　　三氯化鐵 分析純 上海展云化工有限公司</p><p>　　鐵氰化鉀

81、 分析純 上海試劑一廠</p><p>　　鄰苯三酚 分析純 國藥集團化學試劑有限公司</p><p>　　Tris(三羥甲基氨基甲烷) 分析純 上海生物工程有限公司</p><p>　　ED

82、TA Na2 分析純 　寧波神化化學品經營有限責任公司</p><p>　　三氯乙酸 分析純 國藥集團化學試劑有限公司</p><p>　　DPPH?(二苯代苦味?；杂苫? 分析純 和光純藥工業(yè)株式會社

83、（日本）</p><p>　　鹽酸 分析純 杭州化學試劑廠</p><p>　　無水乙醇 分析純 國藥集團化學試劑有限公司</p><p><b>　　2.4 方法</b></

84、p><p>　　2.4.1 鯊魚肉酶解液鈣螯合物的分級沉淀</p><p>　　蛋白酶解液經過鈣離子螯合，得到不同的螯合物，根據(jù)其極性的不同可采用不同濃度的乙醇濃度將其分離［７］。</p><p>　　酶解液鈣螯合物8000rpm離心15 min，沉淀即為水不溶組分(A)；上清液中加入等體積無水乙醇，室溫靜置30min，離心，沉淀即為50％無水乙醇不溶性組分(B)；剩余

85、的上清液中加入無水乙醇，至乙醇濃度達到80％，室溫靜置30min，離心，沉淀即為80％無水乙醇不溶性組分(C)。采用真空冷凍干燥法，將各級樣品冷凍干燥，冷藏備用。</p><p>　　2.4.2 鈣螯合物抗氧化活性的測定</p><p>　　2.4.2.1 TBA法（硫代巴比妥酸法）</p><p>　　將0.2ml亞油酸的樣品加入30ml試管中，然后加入10ml

86、99.5%乙醇和10ml 50mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH7.0)。每一種樣品(50mg)加入到此混合溶液中，然后用蒸餾水定容至25ml。將其放入到培養(yǎng)箱中在40℃培養(yǎng)。</p><p>　　TBA溶液根據(jù)Ohkawa等[8]方法配制，該溶液含有0.8ml水、0.2ml 8.1%SDS和1.5ml 20%的醋酸，后用10mol/L的NaOH和1.5ml 0.8%TBA調pH至3.5。</p&g

87、t;<p>　　將50μl的氧化性亞油酸溶液（分別經40℃培養(yǎng)1天、3天、5天、7天、9天）加入到TBA混合液中，并在5℃培養(yǎng)1h，然后在100℃加熱1h，冷卻后測定535nm吸光值。結果被表示為對亞油酸的氧化抑制率，同α-生育酚（VE）的抗氧化性作對照比較。抑制率的計算公式：</p><p>　　抑制率(%)=（A－B）×100/( A－C)</p><p>　　

88、式中：A為對照組（50μl去離子水、0.2ml亞油酸）的吸光度；B為樣品組（50μl樣品液、0.2ml亞油酸）的吸光度；C為α-生育酚液組（50μl α-生育酚液、0.2ml亞油酸）的吸光度。</p><p>　　2.4.2.2 DPPH·清除能力的測定[9]</p><p>　　具塞試管中加入樣品液2mL及2 mL 1×10-4 mol/L DPPH·溶液(

89、用95%乙醇配制)，搖勻，室溫下密閉靜置30 min，于517 nm下測定吸光度。</p><p>　　DPPH·清除率(%)=[1－(A1－A2)/A0]×100%</p><p>　　式中：A1：酶解液+DPPH·溶液的吸光度；</p><p>　　A2：酶解液+95%乙醇溶液的吸光度；</p><p>　　

90、A0：DPPH·溶液+蒸餾水的吸光度。</p><p>　　2.4.2.3 O2-·自由基清除能力的測定[10]</p><p>　　取50mmol·L-1，pH 8.20 Tris-HCl緩沖液4.5mL(其中含有2mmol·L-1 EDTANa2 )，加入0.3mL不同濃度的樣液，25℃保溫10 min，然后加入25℃預溫的4.5mmol

91、3;L-1的鄰苯三酚(用10mmol·L-1HCl配制) 0.2 mL，混勻后迅速于干燥的比色皿中，在320nm下每隔半分鐘測定一次吸光值（A），測到4min。以等體積10mmol·L-1HCl代替鄰苯三酚溶液為空白調零，對照組以等體積去離子水代替樣品。</p><p>　　作吸光度隨時間變化曲線的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚的自氧化速率V，按下式計算樣品對O2-·的清除率。</

92、p><p>　　式中：V對照-對照組鄰苯三酚自氧化速率( △A/min)；V樣品- 樣品組鄰苯三酚自氧化速率(△A /min)。</p><p>　　2.4.2.4 清除OH·自由基能力測定—鄰二氮菲法[11]</p><p>　　取0.75 mmol·L-1的鄰二氮菲無水乙醇溶液1mL 于試管中，依次加入2mL0.2mol·L-1醋酸鈉緩

93、沖溶液和1mL蒸餾水，充分混勻后，加入0.75 mmol·L-1硫酸亞鐵溶液1mL，混勻后加入0.01%雙氧水1mL ，37℃ 水浴加熱50 min，在536nm測其吸光值，所測吸光值為損傷管的吸光值。</p><p>　　未損傷管以1mL蒸餾水代替損傷管中1mL 0.01%的雙氧水，樣品管以1mL樣品代替損傷管中的1mL蒸餾水，操作方法同損傷管，以蒸餾水調零，測得536 nm未損傷管和樣品管的吸光值。

94、</p><p>　　2.4.3 鈣螯合物抗菌性的測定</p><p>　　2.4.3.1 菌種活化和菌懸液的制備</p><p>　　分別將大腸桿菌Esoherichia coli、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis接種于固體斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h。取活化培養(yǎng)好的菌株，用無菌生理鹽水將

95、菌苔洗下，采用菌落計數(shù)法制成菌體懸浮液，將菌懸液的菌數(shù)稀釋為l×l08CFU/ml。</p><p>　　2.4.3.2 抑菌圈的測定</p><p>　　采用管碟法（牛津杯法）測定[12]。1mL菌懸液與15ml左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基后搖勻，放置冷卻后，用無菌鑷子攝取已經干熱滅菌的牛津杯，輕輕平置于平板表面，每皿等距放入4個牛津杯，每一菌種做2個平皿，用無菌微量注射器按順序分別加

96、入相應濃度的樣品液0.25 mL，平皿的中央用無菌生理鹽水做對照。細菌置于37℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，15 h后測定抑菌圈直徑。</p><p><b>　　2.5 數(shù)據(jù)處理</b></p><p>　　實驗平行次數(shù)35，取平均值作圖。采用圖表法對所得到數(shù)據(jù)進行分析，并通過添加趨勢線的方法分別計算DPPH·清除能力、O2-·自由基清除能力、清除OH

97、83;自由基能力的IC50值。</p><p><b>　　3結果與討論</b></p><p>　　3.1 鯊魚肉酶解液鈣螯合物各級乙醇沉淀產物的得率與性質</p><p>　　利用乙醇對螯合物進行分級沉淀，共有組分A（水不溶物）、組分B（50%乙醇不溶物）和組分C（80%</p><p>　　乙醇不溶物）三種產物，各

98、級產物的得率如圖1所示。</p><p><b>　　圖1 各級產物得率</b></p><p>　　Fig. 1:The yield of three kinds products</p><p>　　其中水不溶物、50%乙醇不溶物、80%乙醇不溶物得率分別為：0.85%、0.86%、1.03%。三種產物經冷凍干燥后特征性質如下：</p

99、><p>　　①組分A：灰白色粉末狀，較細膩，不溶于水。</p><p>　　②組分B：淺褐色晶體狀物質，具有一定的水溶性。</p><p>　　③組分C：深褐色晶體狀物質，干燥前粘性較強，干燥后呈現(xiàn)顆粒狀晶體，水溶性較好，在低濃度的醇溶液中也有良好的溶解性。</p><p>　　3.2 酶解液鈣螯合物的抗氧化性分析</p><

100、;p>　　.3.2.1 螯合物的抗亞油酸氧化能力</p><p>　　油脂受到光、熱、空氣中氧的作用，發(fā)生酸敗反應，分解出醛、酸之類的化合物，丙二醛即是其中的一種分解產物，它能與TBA（硫代巴比妥酸）作用生成粉紅色化合物，在538nm處有吸收峰。利用TBA法，以培養(yǎng)1、3，5，7，9天的亞油酸為原料，分別對水不溶物、50%乙醇不溶物、80%乙醇不溶物的抗氧化性進行測定，并與α-生育酚進行對比，結果如圖2。&

101、lt;/p><p>　　圖2 三種鈣螯合物組分抗亞油酸氧化的能力</p><p>　　Fig. 2 Three kinds of calcium chelates components resistance to linoleic acid oxidation ability</p><p>　　由圖2可知，組分C（80%乙醇不溶物）的抗亞油酸氧化的效果最好，與α-生育

102、酚抗氧化力比值在90.1%101.2%范圍內；其次為組分B（50%乙醇不溶物），與α-生育酚抗氧化力比值在85.1%96.3%范圍內；而組分A（水不溶物）抗氧化能力稍弱，與α-生育酚抗氧化能力的比值在79.6%96.9%范圍內。</p><p>　　3.2.2 螯合物的清除OH·自由基能力</p><p>　　機體在生命活動中會不斷產生各種活性氧自由基(Reactive oxyg

103、en species，ROS)，引起DNA損傷、癌變、細胞衰老等，從而引發(fā)各種疾病，包括腫瘤、衰老、心腦系統(tǒng)損傷，并與神經系統(tǒng)及糖尿病并發(fā)癥等很多疾病的發(fā)生密切相關[13]。各種活性氧自由基中以羥自由基(·OH)作用最強，毒性最大。·OH是一種氧化還原能力很強的自由基，可使體內蛋白質、核酸和多糖發(fā)生氧化而破壞。因此，·OH的存在和人體的衰老、腫瘤等許多疾病有密切關系。根據(jù)鄰二氮菲-Fe2+的溶液呈紅色，在5

104、36nm下產生吸收峰[14]。當鄰二氮菲-Fe2+被反應體系產生的羥自由基氧化后，紅色褪去，536nm吸收值大幅下降。當加入清除劑后，吸收值的下降速度減緩，以此來衡量樣品清除羥自由基的能力。以010 mg·mL-1的濃度梯度分別測定了組分B（50%乙醇不溶物）與組分C（80%乙醇不溶物）清除OH·自由基能力，結果見圖3與圖4。</p><p>　　圖3 80%乙醇不溶物清除OH·自由

105、基能力</p><p>　　Fig 3 OH ? free radical scavenging ability of 80% alcohol insoluble products</p><p>　　由圖3可以看出，組分C（80%乙醇不溶物）具有很好的清除O2-·能力，且與其濃度呈現(xiàn)一定的量效關系，在一定的范圍內呈線性相關，其線性方程為y=6.4145X+12.173（R2=0

106、.8321），計算得出其IC50值為5.60 mg·mL-1。</p><p>　　圖4 組分B（50%乙醇不溶物）清除OH·自由基能力</p><p>　　Fig 4 OH ? free radical scavenging ability of 50% alcohol insoluble products</p><p>　　圖4可以看出，組

107、分B（50%乙醇不溶物）具有較好的清除O2-·能力，且與其濃度呈現(xiàn)一定的量效關系，并在一定的范圍內呈線性相關，其線性方程為y=4.397X-2.424 （R2=0.9664），計算得出其IC50值為11.92mg·mL-1。</p><p>　　由兩者的IC50值可知，組分B的抗氧化效果明顯較組分C差。這可能與組分B的復溶性較差有關，也可能與兩者形成螯合物的小肽氨基酸種類不同有關。</p

108、><p>　　3.2.3 螯合物的DPPH·清除能力</p><p>　　二苯代苦味酰自由基（DPPH·）在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，含有3個苯環(huán)，1個氮原子上有1個孤對電子，呈紫色，在517 nm有強吸收[15]。在有自由基清除劑存在時，DPPH·的單電子被配對而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小，而且這種顏色變淺的程度與配對電子數(shù)是成化學計量關系的

109、，因此可用于檢測自由基的清除情況，該法簡單快速，是最早用于測定抗氧化活性的間接方法[16]。將組分C(80%乙醇不溶物)按010 mg·mL-1的濃度梯度，測定其清除二苯代苦味酰自由基（DPPH·）的能力，結果見圖5。</p><p>　　圖5 組分C（80%乙醇不溶物）清除二苯代苦味酰自由基（DPPH? ）能力</p><p>　　Fig 5 DPPH ? scave

110、nging ability of 80% alcohol insoluble products</p><p>　　由圖5可見，組分C（80%乙醇不溶物）具有顯著的清除DPPH·能力，酶解產物清除DPPH·的能力與其濃度呈現(xiàn)一定的量效關系。當組分C的濃度達到10mg·mL-1時，其對DPPH·的清除能力可以達到80.18%，其線性方程為y=0.7427X2-1.4416X+