遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠早期b細(xì)胞發(fā)育數(shù)量及凋亡情況的影響

1、<p>　　遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠早期B細(xì)胞發(fā)育數(shù)量及凋亡情況的影響</p><p>　　摘 要：目的：探討運(yùn)動(dòng)性免疫失衡對(duì)早期B細(xì)胞發(fā)育及調(diào)節(jié)體系的影響。方法：SPF級(jí)雄性SD大鼠128只，隨機(jī)分成絕對(duì)安靜組（AC）組，運(yùn)動(dòng)前安靜組（A）、運(yùn)動(dòng)后即刻組（J）、運(yùn)動(dòng)后3H組（3H），進(jìn)行6周遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，分別在第0、2、4、6周用四色流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠早期immature B、mature B細(xì)胞群數(shù)量

2、及凋亡情況。結(jié)果：0周：各組間immature B、mature B細(xì)胞群數(shù)量及凋亡情況均無顯著性差異（P>0.05）；2周，與A組相比，J組immature B、mature B數(shù)均呈顯著性下降（P<0.05），3H組均顯著性上升（P<0.05），而J組immature B細(xì)胞凋亡率呈顯著性上升（P<0.05），mature B細(xì)胞凋亡率則呈顯著性下降（P<0.05）；4周：immature B細(xì)胞數(shù)在J

3、組呈顯著性下降（P<0.05），而mature B細(xì)胞數(shù)在3H組呈顯著性上升（P<0.05），J組immature B細(xì)胞凋亡率呈顯著性上升（P<0.05）；6周：J組僅mature B細(xì)胞數(shù)呈顯著性下降（P<0.05），僅immature B細(xì)胞凋亡率J組呈顯著性上升</p><p>　　關(guān)鍵詞：B淋巴細(xì)胞；發(fā)育；調(diào)節(jié)體系；細(xì)胞凋亡；骨髓；運(yùn)動(dòng)性免疫失衡 </p><

4、p>　　中圖分類號(hào)：G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-2076（2013）01-0060-06 </p><p>　　筆者前期的實(shí)驗(yàn)研究證明：“運(yùn)動(dòng)性免疫抑制”最初是針對(duì)T細(xì)胞發(fā)育分化調(diào)節(jié)而言，總結(jié)了前期工作，筆者認(rèn)為針對(duì)B細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的發(fā)育分化調(diào)節(jié)而言，稱之為“運(yùn)動(dòng)性免疫失衡”會(huì)更準(zhǔn)確、全面[1-5]。6周遞增運(yùn)動(dòng)過程中，機(jī)體根據(jù)運(yùn)動(dòng)需要，通過改變凋亡率，進(jìn)而改變?cè)缙诎l(fā)育中Pro

5、 B細(xì)胞、Pre B細(xì)胞的數(shù)量百分比，以盡可能維持免疫穩(wěn)態(tài)，而且發(fā)現(xiàn)Pre B細(xì)胞對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷更敏感，易受運(yùn)動(dòng)的刺激而發(fā)生凋亡，細(xì)胞數(shù)量百分比顯著性下降[1]。也研究了早期B細(xì)胞發(fā)育起著關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子[2]，它們?cè)?周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中，產(chǎn)生的適應(yīng)性及應(yīng)答性變化，以及與Pro B、Pre B細(xì)胞之間的等級(jí)性調(diào)節(jié)。那么，骨髓早期B細(xì)胞在經(jīng)歷了Pro B、Pre B細(xì)胞發(fā)育后的immature B，mature B細(xì)胞階段，又發(fā)

6、生了哪些變化？這些變化與Pro B細(xì)胞、Pre B細(xì)胞的變化又有著怎么樣的聯(lián)系？ </p><p>　　基于此問題的思考，在前期長期遞增負(fù)荷對(duì)早期Pro B細(xì)胞、Pre B細(xì)胞在骨髓中發(fā)育影響的基礎(chǔ)上，利用流式細(xì)胞術(shù)，分析6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)immature B，mature B細(xì)胞數(shù)量與凋亡情況的影響及其與Pro B細(xì)胞、Pre B細(xì)胞的相關(guān)關(guān)系，探討長期運(yùn)動(dòng)對(duì)骨髓早期B細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)性免疫失衡的調(diào)控

7、機(jī)制及進(jìn)一步的干預(yù)措施提供一定的理論依據(jù)。 </p><p><b>　　1 材料與方法 </b></p><p><b>　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 </b></p><p>　　雄性SD大鼠（8周齡，體重130～150 g）128只 （許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0020；NO：0043379，粵監(jiān)證字 F2008A0

8、02），隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組（96只）進(jìn)行 6 周遞增強(qiáng)度訓(xùn)練；絕對(duì)安靜組（對(duì)照組，32只），正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，分別于第 0、2、4、6 周末采樣，用于判別大鼠生長對(duì)測試指標(biāo)的影響（實(shí)驗(yàn)組實(shí)際參與運(yùn)動(dòng)的大鼠是106只，以備補(bǔ)充建模中意外死亡大鼠。本次建模因意外死亡大鼠2只）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組各指標(biāo)各周之間沒有顯著性差異（P>0.05），表明 6 周生長對(duì)這些指標(biāo)沒有顯著影響。 </p><p&

9、gt;　　1.2 運(yùn)動(dòng)模型設(shè)計(jì)、取材時(shí)間及建模測試指標(biāo) </p><p>　　參照Bedfor d（1979）根據(jù)大鼠體重/ 攝氧量回歸方程所建立的遞增負(fù)荷（ 跑臺(tái)坡度），課題組前期通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)性探索獲得的運(yùn)動(dòng)性免疫失衡發(fā)生、發(fā)展的動(dòng)物模型[6-11]：模擬運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練安排，長時(shí)間、大強(qiáng)度且負(fù)荷遞增。 </p><p>　　因此，采用低強(qiáng)度適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)（10 m/min）訓(xùn)練 1 周后，負(fù)荷遞增

10、至 20 m/min。隨后，每周遞增負(fù)荷增量 5 m/min。至第 6 周，達(dá)到 40 m/min，基本達(dá)到大鼠最大負(fù)荷強(qiáng)度。分別在第 0、2、4、6 周最后一次運(yùn)動(dòng)后 48 h 采樣。采樣日進(jìn)行與上周相同負(fù)荷的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，分別在運(yùn)動(dòng)前安靜組（A）、運(yùn)動(dòng)后即刻組（J）、運(yùn)動(dòng)后3H組（3H）無菌取大鼠（股骨）骨髓，用于流式細(xì)胞儀檢測。 </p><p>　　多年來的研究表明，分別從血液指標(biāo)、生化指標(biāo)、脾淋巴細(xì)胞分泌I

11、L-2、sIL-2R、T細(xì)胞活性、巨噬細(xì)胞吞噬能力、白細(xì)胞介素、自由基代謝、抗氧化體系、心肌離子泵、神經(jīng)遞質(zhì)等指標(biāo)，同時(shí)監(jiān)測大鼠體重、皮毛亮度、進(jìn)食飲用水量及飼料量，通過比較對(duì)照組與訓(xùn)練組的這些指標(biāo)的顯著性變化，來驗(yàn)證大鼠6周遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)模型的建立是成功的[6-11]。 </p><p>　　1.3 主要試劑與儀器 </p><p>　　主要試劑：Alexa Fluor 647 ant

12、i-rat CD45RA，產(chǎn)品編號(hào)202312，購自BioLegend；Phycoerythrin （PE） anti-rat IgM，產(chǎn)品編號(hào)12-0990，購自eBioscience；Phycoerythrin （PE） Mouse IgG1， κIsotype Ctrl，產(chǎn)品編號(hào)12-4714，購自eBioscience；FITC anti-rat IgD （H6/31），產(chǎn)品編號(hào)sc-53081，購自Santa Cruz；nor

13、mal mouse IgM-FITC，產(chǎn)品編號(hào)sc-2859，購自Santa Cruz；7-AAD，產(chǎn)品編號(hào)00-6993，購自eBioscience；BD Calibrite 3 Beads（FITC，PE，PerCP） 產(chǎn)品編號(hào)340486，購自BD PharmingenTM；BD Calibrite APC Bead產(chǎn)品編號(hào)340487，購自BD PharmingenTM。主要儀器：美國BD公司FASC Calibur流式細(xì)胞儀；

14、日本OLYMPUS倒置生物顯微鏡；美國Thermo FORMA 725超</p><p>　　活體麻醉大鼠取股骨，置冰上快速用16號(hào)針頭抽取骨髓；制備新鮮骨髓單細(xì)胞懸液，對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)至5×106/ml。骨髓中兩個(gè)亞群的表型分別為：Immature B cell：CD45RA+ （IgM+ IgD-）；mature B cell：CD45RA+ （IgM+ IgD+）；采用直接染色法，在流式細(xì)

15、胞儀FACS Calibur（BD公司）上收集并進(jìn)行表型分析。 </p><p><b>　　1.5 數(shù)據(jù)處理 </b></p><p>　　所有數(shù)值均以（±SD）表示，SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件完成，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析。顯著性差異水平為P<0.05，非常顯著性差異水平為P<0.01。 </p&g

16、t;<p><b>　　2 研究結(jié)果 </b></p><p><b>　　3 討論與分析 </b></p><p>　　3.1 6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)immature B細(xì)胞數(shù)量的影響 </p><p>　　Pre B細(xì)胞輕鏈基因成功重排后，B細(xì)胞膜上就開始出現(xiàn)單體膜型IgM，這標(biāo)志著B細(xì)胞抗原非依賴階段imm

17、ature B細(xì)胞發(fā)育的完成。此時(shí)通過克隆刪除，形成自身免疫耐受，發(fā)育為表達(dá)mIgM+mIgD+的成熟B細(xì)胞（mature B cell），離開骨髓進(jìn)入外周免疫器官。 </p><p>　　6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過程中，在WK0，運(yùn)動(dòng)并未對(duì)骨髓早期B細(xì)胞數(shù)量百分比造成明顯影響，但從WK2開始，各運(yùn)動(dòng)組B淋巴細(xì)胞出現(xiàn)較明顯波動(dòng)，表明一次性的短時(shí)間運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)骨髓幾乎沒有影響，然而大強(qiáng)度、長時(shí)間訓(xùn)練對(duì)骨髓早期B細(xì)胞發(fā)育有較顯

18、著的影響。 </p><p>　　經(jīng)過長期的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，骨髓immature B細(xì)胞數(shù)量百分比出現(xiàn)不同時(shí)相的顯著性變化（見圖2-A），提示隨訓(xùn)練時(shí)間的延長，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增強(qiáng)，運(yùn)動(dòng)量的積累對(duì)immature B細(xì)胞的影響漸趨增強(qiáng)，提示6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中，immature B細(xì)胞漸趨對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激的敏感性提高。結(jié)合我們前期對(duì)Pro B、Pre B細(xì)胞的研究結(jié)果[1]，推測是機(jī)體根據(jù)運(yùn)動(dòng)的需要，通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞所占骨髓總細(xì)胞的數(shù)

19、量百分比，盡力維持免疫穩(wěn)態(tài)。 </p><p>　　可能的原因，一方面是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的骨骼肌適應(yīng)性改變的發(fā)生可能伴隨如中性粒細(xì)胞和吞噬細(xì)胞在肌肉損傷處聚集、骨骼肌白細(xì)胞浸潤等炎癥反應(yīng)。有研究顯示機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)，在多種炎性介質(zhì)誘導(dǎo)下早期造血細(xì)胞更傾向于向髓系方向分化，而抑制向淋巴系的分化[12]。 </p><p>　　推測另一方面可能是由于運(yùn)動(dòng)能夠影響各群B淋巴細(xì)胞的分化成熟的同時(shí)，各種應(yīng)激激

20、素的產(chǎn)生，也誘導(dǎo)早期B細(xì)胞的大量凋亡，導(dǎo)致骨髓內(nèi)各群早期B淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少。因此，我們繼續(xù)研究了6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)骨髓早期B細(xì)胞發(fā)育各階段細(xì)胞凋亡的影響。此外，還可能與運(yùn)動(dòng)大量耗能，骨髓發(fā)育中B細(xì)胞對(duì)葡萄糖和氨基酸的攝取減少有關(guān)。 </p><p>　　3.2 6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)immature B細(xì)胞凋亡的影響 </p><p>　　在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能行使過程中，細(xì)胞凋亡始終扮演重要

21、角色，淋巴細(xì)胞的分化、成熟乃至死亡過程都伴隨著凋亡。 </p><p>　　本實(shí)驗(yàn)用流式7-AAD染料，不含固定劑的紅細(xì)胞溶血素處理細(xì)胞，染上 7-AAD的細(xì)胞是中晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞。因嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件的一致性，可認(rèn)為各組壞死細(xì)胞數(shù)相近，故各組的染色細(xì)胞的比較，可以認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的比較，也被業(yè)內(nèi)人士認(rèn)可。 </p><p>　　Lu L等運(yùn)用不同的實(shí)驗(yàn)方法證明發(fā)育中B細(xì)胞的丟失是由凋亡

22、造成[13-15]。 當(dāng)未成熟細(xì)胞開始表達(dá)IgM時(shí)，將會(huì)遇到并識(shí)別骨髓微環(huán)境中的自身抗原，部分表達(dá)抗自身抗原受體的B細(xì)胞與抗原結(jié)合后被誘導(dǎo)凋亡而清除。 </p><p>　　本研究中immature B細(xì)胞凋亡率的變化特征揭示，隨著運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增加和訓(xùn)練時(shí)間的延長，應(yīng)該是機(jī)體根據(jù)運(yùn)動(dòng)需要，通過改變凋亡率，進(jìn)而改變B細(xì)胞所占骨髓總細(xì)胞的數(shù)量百分比，以求緩解運(yùn)動(dòng)性免疫失衡（如細(xì)胞免疫的抑制；體液免疫的亢進(jìn)，外周B細(xì)胞數(shù)

23、量增多但分泌免疫球蛋白功能降低等），盡可能的維持免疫穩(wěn)態(tài)。各早期B細(xì)胞亞群凋亡率的增加，推測可能是運(yùn)動(dòng)減少了早期發(fā)育中各B細(xì)胞亞群細(xì)胞膜表面抗凋亡蛋白 Bcl-2的表達(dá)而促成的。 </p><p>　　流式實(shí)驗(yàn)檢測到的凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，其實(shí)僅是代表了在一個(gè)短暫時(shí)刻里可獲取的、并且是在體非體外培養(yǎng)狀態(tài)中的大量凋亡細(xì)胞的一小部分，而且是撲捉了在凋亡發(fā)生伊始與巨噬細(xì)胞吞噬這一時(shí)間段內(nèi)的細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)測得的骨髓中早期B

24、細(xì)胞的凋亡，只是一個(gè)相對(duì)的凋亡活動(dòng)，本身并不能給予一個(gè)在體的真實(shí)凋亡率。因此，今后觀測早期B細(xì)胞在體發(fā)育的凋亡率，有待于探索一種更直接的檢測方法。 </p><p>　　3.3 6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)mature B細(xì)胞數(shù)量及其凋亡的影響 </p><p>　　B前體細(xì)胞在骨髓中的發(fā)育由Immature B細(xì)胞向mature B細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，經(jīng)歷了陰性選擇，從而保證有效產(chǎn)生的mature B

25、細(xì)胞對(duì)自身抗原的免疫耐受，防止自身免疫性疾病的發(fā)生，所以在immature B細(xì)胞向mature B細(xì)胞轉(zhuǎn)化的這一過程對(duì)機(jī)體來說是至關(guān)重要的。 </p><p>　　6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過程中，mature B細(xì)胞數(shù)量百分比及凋亡率的適應(yīng)性變化特征是：與WK0 A相比，mature B在WK2 A呈顯著性上升（P0.05），WK6 A顯著性高于WK0 A（P0.05）（見圖3-B）。與前期工作中Pro B、Pre B

26、[1]、immature B細(xì)胞數(shù)量百分比的變化相比，實(shí)驗(yàn)采點(diǎn)相同時(shí)相下，本研究中mature B則呈現(xiàn)較多的反相變化趨勢（見圖2-B，圖3-B），推測由以下因素造成。 </p><p>　　Laakko等[16]模擬了應(yīng)激下的CS（皮質(zhì)酮）濃度（60～95μg/ dl血液），觀察12～36h內(nèi)CS對(duì)BM（骨髓）中的各發(fā)育階段B細(xì)胞的影響。發(fā)現(xiàn)：不成熟B細(xì)胞，由占BM所有細(xì)胞數(shù)的約7%下降到不足1%。成熟B細(xì)胞并

27、未受CS的負(fù)面影響，由占BM4%上升為12%，增加了近3倍。研究者們對(duì)增多的成熟B細(xì)胞的來源也不清楚，推測是外周B細(xì)胞歸巢入骨髓所導(dǎo)致；另一方面，可能與骨髓早期B細(xì)胞各亞群抗凋亡原癌基因bcl-2的表達(dá)量多少有關(guān)。在細(xì)胞進(jìn)行基因重排時(shí)觀測到抗凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)，只有在prepro B細(xì)胞（前祖B細(xì)胞）和mature B細(xì)胞表達(dá)大量的Bcl-2。 　　其他研究報(bào)道揭示在Pre B階段，可誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的TLR信號(hào)能夠促進(jìn)Pr

28、e B細(xì)胞表達(dá)IgM，成為新生B淋巴細(xì)胞[17]。另有其他研究者們進(jìn)一步推測成熟B細(xì)胞的增多是由于自身反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞因逃避陰性選擇過程而存活下來[18]，這是由可誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的TLR4信號(hào)促成的。還有研究揭示，一些自身反應(yīng)性的B細(xì)胞在陰性選擇過程中并不一定走向凋亡，而是有可能返回到上一個(gè)階段重新進(jìn)行V-D-J重排，重新產(chǎn)生成</p><p>　　Osmond、Stephan、Cancro等先后提出了代償

29、機(jī)制學(xué)說[17，20]。他們認(rèn)為，當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激或其他需要更多能量輸出狀態(tài)下，存在代償機(jī)制，出現(xiàn)骨髓mature B淋巴細(xì)胞增多現(xiàn)象。研究顯示Pro B細(xì)胞隨年齡增長數(shù)量變化不大，但對(duì)IL-7刺激的增殖能力下降，Pre B細(xì)胞數(shù)量減少，但機(jī)體通過代償機(jī)制使存活的Pre B細(xì)胞更多的分化成為mature B淋巴細(xì)胞，以適應(yīng)機(jī)體整合需要[20]。 </p><p>　　本研究中mature B細(xì)胞的變化特征，產(chǎn)生原因

30、可能是在6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中，長時(shí)間的運(yùn)動(dòng)消耗，引起HPA軸活動(dòng)加強(qiáng)，皮質(zhì)酮明顯上升，機(jī)體分解代謝加速；同時(shí)，雄激素分泌減少，合成代謝減弱，以此滿足持續(xù)運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體大量耗能的需求。推測這些變化驅(qū)動(dòng)了骨髓發(fā)育中B細(xì)胞的代償機(jī)制，即促使存活的Pre B細(xì)胞更多的分化為mature B細(xì)胞，以適應(yīng)機(jī)體大量耗能的需要。 </p><p>　　運(yùn)動(dòng)對(duì)早期B淋巴細(xì)胞發(fā)育的影響，涉及多方面、錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)節(jié)因素網(wǎng)絡(luò)，今后還有大量的實(shí)

31、驗(yàn)研究工作待進(jìn)行。如圖4所示，本課題研究希望進(jìn)一步通過組織學(xué)觀察，細(xì)胞水平，轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子及其受體、趨化因子及其受體、Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等各層面進(jìn)一步探討長期運(yùn)動(dòng)對(duì)骨髓早期B細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)性免疫失衡的調(diào)控機(jī)制及進(jìn)一步的干預(yù)措施提供理論依據(jù)。 </p><p><b>　　4 研究結(jié)論 </b></p><p>　　4.1 提示6周遞增運(yùn)動(dòng)過程中，機(jī)

32、體根據(jù)運(yùn)動(dòng)需要，通過改變凋亡率，進(jìn)而促成早期發(fā)育中B細(xì)胞的數(shù)量百分比的改變，以求緩解運(yùn)動(dòng)性免疫失衡（如細(xì)胞免疫的抑制、體液免疫的亢進(jìn)等），盡可能維持免疫穩(wěn)態(tài)； </p><p>　　4.2 聯(lián)系前期對(duì)Pro B、Pre B細(xì)胞數(shù)量及凋亡率的影響，本研究提示隨訓(xùn)練時(shí)間的延長，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增強(qiáng)，運(yùn)動(dòng)應(yīng)激對(duì)mature B凋亡率的影響卻是漸趨減弱的； </p><p>　　4.3 結(jié)合前期對(duì)Pro

33、 B、Pre B細(xì)胞的研究工作，實(shí)驗(yàn)采點(diǎn)相同時(shí)相下，本研究中mature B則呈現(xiàn)較多的反相變化趨勢。提示6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可能通過代償機(jī)制促使存活的Pre B細(xì)胞更多地分化為mature B淋巴細(xì)胞，以適應(yīng)機(jī)體大量耗能的需要。 </p><p>　?。ǜ兄x華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院郝選明教授在實(shí)驗(yàn)研究中給予的指導(dǎo)與資助。） </p><p><b>　　參考文獻(xiàn)： </b&g

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