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文檔簡介
1、<p> 本科畢業(yè)論文(設計)</p><p> 論文題目:白腐真菌處理有機固體廢物過程中脂肪合成現(xiàn)象的研究I—平菇脂肪合成現(xiàn)象的初步研究</p><p> 所在學院 生物與環(huán)境學院 </p><p> 專業(yè)班級 環(huán)境工程 </p><p> 學生姓名
2、 學號 </p><p> 指導教師 職稱 </p><p> 完成日期 年 月 日</p><p><b> 摘 要</b></p><p> 本實驗利用kirk培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)平菇菌絲體,從兩方面研
3、究平菇菌絲體生長過程中脂肪合成規(guī)律。首先驗證平菇菌絲體生長過程中產生脂肪,其次研究營養(yǎng)因子對平菇產脂的影響。利用蘇丹黑B染色法對菌絲體進行染色,發(fā)現(xiàn)顯微鏡下存在藍灰色的脂肪粒。分別采用干重法和酸熱法測定菌絲體的生物量和脂肪含量,并發(fā)現(xiàn)它們均先增加后減少,且在培養(yǎng)第10天,脂肪含量達到最高值4.16%。此外,利用PB實驗設計對影響脂肪含量的5個因素(葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2)進行篩選。經過
4、篩選,發(fā)現(xiàn)葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4這3個因素對脂肪含量的影響最大。然后進行最陡爬坡實驗逼近關鍵因素的最大響應區(qū)域。最后采用Box-Benhnken實驗設計對培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化,確定最優(yōu)培養(yǎng)基。結果表明,葡萄糖9.2 g/L、酒石酸銨0.82 g/L、KH2PO40.86 g/L,理論脂肪含量達到最高值11.36%。</p><p> 關鍵詞:平菇;脂肪含量;Plackett-Burman設計;最陡爬坡實驗
5、;Box-Behnken實驗設計;營養(yǎng)因子</p><p><b> ABSTRACT</b></p><p> In this study, using the kirk medium staticly culture mycelium of Pleurotus ostreatus and studying the the law of producing li
6、pid in two ways. First, verifing mycelium of Pleurotus ostreatus can produce lipid. Next, studying the impact of nutritional factors on the lipid content of Pleurotus ostreatus. The mycelium were stained with Sudan black
7、 B and observed the obvious blue-gray lipid granules under the microscope. Respectively, adopting the dry weight method and acid-heat method for the deter</p><p> Key Words:Pleurotus ostreatus; lipid conten
8、t; Plackett-Burman design; steepest ascent design; Box-Behnken experimental design; nutritional factors</p><p><b> 目 錄</b></p><p><b> 1 前言1</b></p><p><
9、;b> 2 實驗材料2</b></p><p> 2.1 菌種來源2</p><p><b> 2.2 培養(yǎng)基2</b></p><p> 2.3 實驗試劑2</p><p> 2.4 實驗儀器設備2</p><p> 3 實驗方法與設計3</p&g
10、t;<p> 3.1 實驗方法3</p><p> 3.1.1 菌種復活與續(xù)代培養(yǎng)3</p><p> 3.1.2 平菇培養(yǎng)方法3</p><p> 3.1.3 蘇丹黑B染色法3</p><p> 3.1.4 生物量測定方法4</p><p> 3.1.5 脂肪含量測定方法4<
11、;/p><p> 3.2 實驗設計4</p><p> 3.2.1 平菇產脂的驗證實驗4</p><p> 3.2.2 Plackett-Burman 實驗設計4</p><p> 3.2.3 最陡爬坡實驗(Steepest ascent design)5</p><p> 3.2.4 Box-Benhn
12、ken實驗設計6</p><p><b> 4 結果與分析7</b></p><p> 4.1 驗證平菇產脂的實驗分析7</p><p> 4.1.1 平菇生物量的變化分析7</p><p> 4.1.2 平菇產脂情況分析8</p><p> 4.1.3 平菇菌絲體蘇丹黑B染色
13、結果分析10</p><p> 4.2 營養(yǎng)因子對平菇產脂影響的分析10</p><p> 4.2.1 Plackett-Burman法篩選影響培養(yǎng)基的主要因素10</p><p> 4.2.2 最陡爬坡實驗(Steepest ascent design)確定因素水平12</p><p> 4.2.3 Box-Benhnken
14、實驗確定主要因素的最優(yōu)水平12</p><p><b> 5 討論16</b></p><p><b> 6 結論17</b></p><p><b> 參考文獻18</b></p><p><b> 致 謝20</b></p&g
15、t;<p> 附錄3 脂肪的國標測定方法41</p><p><b> 1 前言</b></p><p> 白腐真菌是一類絲狀真菌因腐生在樹木或木材上,引起木質白色腐爛而得此名。它依靠降解木質纖維材料的能力穿入木質,侵入木質細胞腔內,釋放降解木質素和其他木質組分的酶,導致木質腐爛成為淡色的海綿狀團塊—白腐[1]。人類對于白腐真菌的研究已有近半個世
16、紀的歷史,因其特殊的生理生化機制及強大的降解代謝能力,已成為近年來國內外研究的熱點。白腐真菌不僅能降解各種結構不同的化學物,甚至連雜酚油、氯代芳烴化合物這樣的混合污染物也能完全礦化[2],所以它特有的降解機制在工業(yè)廢水中有廣闊的前景。目前,因為白腐真菌的菌絲體對金屬離子和異生物質有強有力的吸附作用[3,4],使其成為新的生物吸附劑而被研究、制備和開發(fā)。此外,利用白腐真菌混合發(fā)酵秸稈飼料,不僅產生一定量的粗蛋白,而且還能產生大量的小分子營
17、養(yǎng)物質,如糖類、有機酸等。由于這些營養(yǎng)物質的存在一方面提高了動物的消化吸收率,提高了飼料的營養(yǎng)水平,另一方面也明顯地改善了飼料的理化性狀[5-9]。</p><p> 在白腐真菌處理木粉雞糞混合物的時候,研究人員發(fā)現(xiàn)白腐真菌及其培養(yǎng)基混合的基材中脂肪含量有一個奇特的現(xiàn)象,即脂肪量隨實驗時間的增長呈現(xiàn)出先增加后減少的規(guī)律[10]。因此深入研究白腐真菌的脂肪合成規(guī)律,不僅可以填補脂肪代謝研究的空白,還可以有效控制白
18、腐真菌處理有機固廢后產生的菌糠中脂肪的含量。</p><p> 由于目前基本沒有白腐真菌脂肪代謝研究的相關報道,所以本課題參考研究產油微生物的技術方法,選取白腐真菌中的平菇(Pleurotus ostreatus)作為研究對象,研究平菇在其生長過程中是否有脂肪的合成和脂肪合成的規(guī)律。本實驗采用蘇丹黑B染色法定性驗證平菇菌絲體內存在脂肪,再用酸熱法定量測定平菇的脂肪含量。首先,本實驗應用Plackett-Burm
19、an 實驗設計對影響平菇產脂的培養(yǎng)基組分進行篩選。接著進行最陡爬坡實驗逼近關鍵因素的最大響應區(qū)域。最后,采用Box-Benhnken 實驗設計對培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化,確定最優(yōu)培養(yǎng)基。通過研究平菇菌絲體脂肪合成的規(guī)律,可以為白腐真菌處理固體廢物時脂肪代謝的控制打下一定的實驗基礎,為其脂肪酶組成的研究奠定一定的理論基礎。</p><p><b> 2 實驗材料</b></p>&l
20、t;p><b> 2.1 菌種來源</b></p><p> 本研究選用的白腐真菌菌種為平菇(Pleurotus ostreatus),由中國科學院微生物研究所菌種保藏中心提供。</p><p><b> 2.2 培養(yǎng)基 </b></p><p> PDA培養(yǎng)基:稱取200g馬鈴薯,洗凈去皮切碎,加純水100
21、0ml,放在電爐上加熱,煮沸30min,然后用紗布過濾,濾液置500mL的錐形瓶中,接著在高壓滅菌鍋內(121℃,1.2大氣壓)滅菌40min,滅菌后冷卻,放入冷藏柜保存土豆濾液。移取400mL土豆液,加入4g葡萄糖和10g瓊脂,待充分溶解后在高壓滅菌鍋內(121℃,1.2大氣壓)滅菌40min,取出后倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中,每個培養(yǎng)皿大約為15~20 mL,冷卻凝固。</p><p> Kirk培養(yǎng)基:20g/
22、L葡萄糖(112mmol/L)、0.5g/L酒石酸銨(2.7mmol/L)、2.0g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.132g/L CaCl2 、1mg/L VB1及1ml/L微量元素(成分:CuSO4·5H2O 0.08g/L、H2MoO4 0.05g/L、MnSO40.07 g/L、ZnSO4 0.043g/L、 Fe2(SO4)3 0.05 g/L),100mL醋酸緩沖劑(pH4.5)
23、、用土豆濾液配制成1000ml[11,12]。</p><p><b> 2.3 實驗試劑</b></p><p> 用于菌絲體脂質染色的試劑包括蘇丹黑B;藏紅T(番紅O);二甲苯;無水乙醇。用于菌絲體脂質提取的試劑包括鹽酸;石油醚(30℃~60℃沸程);乙醚。用于配制Kirk培養(yǎng)基基質的試劑包括葡萄糖;酒石酸銨;KH2PO4;CaCl2;MgSO4·7
24、H2O;VB1;CuSO4·5H2O;H2MoO4;MnSO4;ZnSO4;Fe2(SO4)3;醋酸鈉;冰醋酸。以上化學試劑均為分析純。</p><p> 2.4 實驗儀器設備</p><p> 本實驗使用的主要儀器包括N-117M型顯微鏡;SW-CJ-5超凈工作臺;YXQ-75S11立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器;HWS型恒溫恒濕箱;FA2004型電子天平;HWS-28數(shù)顯恒溫
25、水浴鍋;WMK-02恒溫電熱干燥箱;通風櫥;培養(yǎng)瓶。</p><p><b> 3 實驗方法與設計</b></p><p><b> 3.1 實驗方法</b></p><p> 3.1.1 菌種復活與續(xù)代培養(yǎng)</p><p> 配制PDA培養(yǎng)基,制成平板,在高壓滅菌鍋(121℃,1.2個大氣
26、壓)中滅菌30min,放置在無菌條件下冷卻后,用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基中取一小塊母種,接種到PDA培養(yǎng)基上,置于溫度為25℃、濕度為65%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至菌絲體長滿整個培養(yǎng)基。再按上述的方法,用打孔器從復活培養(yǎng)后的母種中取一塊圓形菌絲塊,植入新的PDA培養(yǎng)基中,在溫度為25℃、濕度為65%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至菌絲體長滿整個培養(yǎng)基。</p><p> 3.1.2 平菇培養(yǎng)方法</p>
27、<p> 采用靜置培養(yǎng)方式,將配制的Kirk培養(yǎng)基分別裝入培養(yǎng)瓶中,每瓶培養(yǎng)瓶中裝50ml培養(yǎng)基,在高壓滅菌鍋(121℃,1.2大氣壓)中滅菌40 min。滅菌后,把培養(yǎng)瓶從高壓滅菌鍋中取出放入超凈臺內,待冷卻至室溫。采用打孔器(直徑1.0cm)在PDA培養(yǎng)基上打孔取菌塊,然后將菌塊接入培養(yǎng)瓶里,使菌塊漂浮在Kirk培養(yǎng)基表面上。接種后將培養(yǎng)瓶放入溫度為25℃,濕度為65%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20天。每個培養(yǎng)基設置6個平行樣
28、。</p><p> 3.1.3 蘇丹黑B染色法</p><p> 用酒精棉將載玻片擦拭一遍,再滴一滴蒸餾水于載玻片上,挑取少許菌絲體于其中,涂抹均勻,然后進行熱固定。待冷卻后,加一滴0.3%蘇丹黑B染色液染色菌絲體,自然干燥10~15min。再滴加二甲苯對菌絲體脫色直至洗出液透明。干燥后番紅復染1~2min,水洗至洗出液透明。干燥后鏡檢,在光學顯微鏡(1600×)下觀察[1
29、3-15]。</p><p> 3.1.4 生物量測定方法</p><p> 先把定量濾紙放到80℃的烘箱中烘至恒重量,然后放到干燥器中冷卻到室溫稱得質量m1。用布氏漏斗過濾分離菌球與培養(yǎng)基,用蒸餾水沖洗菌球表面,然后把濾紙及濾紙上的菌球放到80℃的烘箱內烘至恒重。最后放到干燥器中冷卻到室溫稱得質量m2。</p><p> 菌球干重m=m2-m1[16]。&l
30、t;/p><p> 3.1.5 脂肪含量測定方法</p><p> 脂肪含量測定方法采用GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》中的酸水解法(又稱酸熱法),具體實驗操作步驟見附錄3[17,18]。</p><p><b> 3.2 實驗設計</b></p><p> 3.2.1 平菇產脂的驗證實驗<
31、/p><p> 在25℃,濕度為65%的恒溫恒濕箱中,用Kirk培養(yǎng)基培養(yǎng)平菇20天。從中抽取2、4、6、8、10、12、14、16、18、20這10個培養(yǎng)時間點的實驗組,每個實驗組設6個平行樣,其中1個為染色所用,其余為測定樣。先測定每個實驗組菌絲體的生物量,再用蘇丹黑B染色法染色平菇菌絲體,顯微鏡下觀察菌絲體內脂肪的情況。最后采用酸熱法測定平菇的產脂情況,包括測定菌絲體以及它的培養(yǎng)基脂肪含量。</p>
32、;<p> 3.2.2 Plackett-Burman 實驗設計</p><p> PB法是一種近飽和的2水平實驗設計方法。它基于非完全平衡塊原理,能用最少實驗次數(shù)估計出因素的主效應,以從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素供進一步研究。每個因素的兩水平分別取低水平與高水平[19]。</p><p> 根據(jù)白腐真菌生長所需的營養(yǎng),結合營養(yǎng)因子對產油微生物產
33、脂影響的報道[20-23],本實驗應用Plackett-Burman 設計法對影響平菇產脂的培養(yǎng)基組分進行篩選,將葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2定為設計因素,其他</p><p> 因素如微量元素、VB1、緩沖溶液、溫度等均恒定。這5個因素水平見表1。然后,通過Minitab 軟件對上述的5個因素設計實驗次數(shù)N=12的實驗,具體情況見表2。</p>&l
34、t;p> 表1 Plackett-Burman實驗設計因素和水平</p><p> 表2 Plackett-Burman 實驗設計結果</p><p> 3.2.3 最陡爬坡實驗(Steepest ascent design)</p><p> 根據(jù)實驗設計結果確定顯著影響因素,以擬合的回歸方程模型的系數(shù)符號和大小來設定顯著影響因素的步長及變化方向,使
35、響應值快速逼近最大響應區(qū)間[24]。依據(jù)Plackett-Burman實驗結果,確定葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4是影響平菇產脂的主要因素,再進行最陡爬坡實驗。然后根據(jù)各因素效應值的大小確定變化方向和步長,最后快速、經濟地逼近最佳區(qū)域。表3為最陡爬坡實驗設計結果。</p><p> 表3 最陡爬坡實驗設計結果</p><p> 3.2.4 Box-Benhnken實驗設計</p&
36、gt;<p> BBD法是利用合理的實驗設計并通過實驗得到一定數(shù)據(jù),采用多元二次方程來擬合因素和響應值之間的函數(shù)關系,以對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝,解決多變量問題的一種統(tǒng)計學方法[25]。根據(jù)最陡爬坡實驗的結果,設計Box-Benhnken實驗的因素與水平,進行3因素3水平的響應面分析實驗。運用Design Expert軟件,得到17個培養(yǎng)基配方,每個配方2個平行樣。其具體的3個因素水平見表4、Box-Benhnke
37、n實驗設計結果見表5。</p><p> 表4 響應面Box-Behnken實驗設計因素和水平</p><p> 表5 響應面Box-Behnken實驗設計結果</p><p><b> 4 結果與分析</b></p><p> 4.1 驗證平菇產脂的實驗分析</p><p> 4.1.
38、1 平菇生物量的變化分析</p><p> 圖1 平菇的菌絲體生長情況</p><p> 用Kirk培養(yǎng)基,在溫度25℃,濕度為65%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)平菇20天,從中抽取2、4、6、8、10、12、14、16、18、20這10個培養(yǎng)時間點的實驗組進行生物量以及脂肪含量的檢測。整個實驗過程中,平菇菌絲體隨著培養(yǎng)時間的增加先增加后減少(如圖1)。所測得生物量也隨著培養(yǎng)時間的增加呈現(xiàn)先增加
39、后減少的趨勢(如圖2)。初始,將平菇菌塊植入培養(yǎng)瓶內,菌塊處于培養(yǎng)瓶中間,培養(yǎng)基清澈,顏色為深黃色。第二天,菌塊邊緣有一圈薄薄的蓬松的菌絲體長出。第4天菌絲體逐漸變大,第6天菌絲體繼續(xù)增大,菌絲體呈現(xiàn)白色且比較蓬松。到第8天,菌絲體快長滿整個培養(yǎng)瓶且變得比較緊密。培養(yǎng)至第10天,培養(yǎng)基表面已長滿菌絲體,此時的培養(yǎng)基顏色變淺,并且由于菌絲體產生許多代謝物使得培養(yǎng)基變得比較渾濁。至第16天菌絲體的生物量達到最大值0.3315g。當培養(yǎng)至第1
40、8天,菌絲體呈現(xiàn)淡黃色,整個培養(yǎng)基的液體明顯減少,且呈粘稠狀,里面存在許多平菇的絮狀代謝物,同時菌絲體生物量有所減少,減少到0.3285g。</p><p> 通過t檢驗和觀察圖2,發(fā)現(xiàn)前16天各個點之間生物量具有顯著差異性(P<0.05),平菇菌絲體快速生長,這可能是因為培養(yǎng)基內有足夠的營養(yǎng)提供菌絲體生長。第16、18、20之間沒有顯著性差異(P>0.05),生物量緩慢下降。這可能是因為培養(yǎng)基里的
41、營養(yǎng)不足,菌絲體停止生長,甚至發(fā)生自溶現(xiàn)象。 </p><p> 所以平菇菌絲體在前期快速生長,第10天菌絲體長滿整個培養(yǎng)瓶,當培養(yǎng)至第16天,菌絲體達到最大值0.3315g,隨后生物量緩慢下降,第20天時,生物量下降至0.3214g。</p><p> 圖2 平菇菌絲體在不同時期的生物量</p><p> 4.1.2 平菇產脂情況分析</p>
42、<p> 本實驗采用酸熱法每兩天對平菇菌絲體內脂肪進行一次定量測定。平菇菌絲體內脂肪含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢如圖3所示。在生長初期,菌絲體內脂肪含量上升,當培養(yǎng)到第10天時候,脂肪含量達到最高值4.16%。然后開始下降。 通過t檢驗,發(fā)現(xiàn)第2天與第4天之間的脂肪含量具有顯著地差異性(P<0.05),可見,前4天的脂肪含量迅速增加,第4、6、8、10天之間的脂肪含量無顯著差異性(P>0.05),脂肪含量緩慢
43、增加。第10天,脂肪含量達到最大值。第12、14、16、18天之間的脂肪含量也沒有顯著差異性(P>0.05),脂肪含量慢慢減少。前4天脂肪含量迅速上升是由于生長初期,菌體利用培養(yǎng)基內豐富的碳氮源,細胞增殖,并快速合成積累脂肪[26]。一般情況下,培養(yǎng)基中含氮量高,則細胞中蛋白質含量也高且油脂積累量也比較高[23]。第4天后碳氮源逐漸減少,一定程度減緩了平菇油脂的合成速度。當培養(yǎng)時間到第10天時,脂肪含量達到最高值。第10天以后脂肪
44、含量逐漸減少,是因為培養(yǎng)基內營養(yǎng)元素已不足以供其生長,所以平菇不得不以自身體內的甘油三酯作為能源來維持生長。</p><p> 圖3 平菇菌絲體在不同時期的脂肪含量</p><p> 除了測定平菇菌絲體內脂肪含量,還測定了過濾后的培養(yǎng)基的脂肪含量。每個實驗組3個平行樣。首先測定培養(yǎng)基的空白樣,發(fā)現(xiàn)錐形瓶無增重。因為Kirk培養(yǎng)基是無機鹽配制的,土豆濾液作為復合型溶液,其脂肪含量是微量的
45、可以忽略不計。測定第2天和第4天的培養(yǎng)基瓶子分別增重0.0273g和0.0266g,錐形瓶底部有一點點油跡。測定第6天和第8天的培養(yǎng)基瓶子分別增重0.0125g和0.0294g.。測定第10天和第12天的培養(yǎng)基瓶子分別增重0.0162g和0.0158g。培養(yǎng)基內具體脂肪含量變化見圖4。分析實驗數(shù)據(jù)和觀察圖4,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基脂肪含量首先數(shù)值均很小、且各個數(shù)據(jù)之間相差較大,比較散亂,無一定的規(guī)律性。另外發(fā)現(xiàn)這些數(shù)據(jù)的標準偏差都很大,準確性不高,
46、這可能是由于實驗操作不當造成的。此外,培養(yǎng)后的培養(yǎng)基中脂肪含量的增加可能是在菌絲體生長階段通過菌絲產酶的結果。這些脂肪可用來合成子實體細胞壁[27]。若沒有子實體,合成的油脂會保留在培養(yǎng)基中,使得培養(yǎng)基內脂肪含量增加[28]??梢姡囵B(yǎng)基內脂肪含量有待深入研究。</p><p> 圖4 平菇培養(yǎng)基內不同時間脂肪含量</p><p> 4.1.3 平菇菌絲體蘇丹黑B染色結果分析</
47、p><p> 采用蘇丹黑B染色法對平菇菌絲體進行染色,然后在光學顯微鏡下觀察菌絲體的染色情況。通過觀察油脂粒大小和多少可以粗略判斷油脂含量。由于蘇丹黑B為重氮染料,能溶解于細胞內的含脂結構(如中性脂肪、磷脂、糖脂和類固醇),對菌體染色后,會使脂肪粒呈藍紫色或紫黑色。圖5為平菇菌絲體第4、10、16天的染色圖片。從圖中觀察發(fā)現(xiàn)第4天平菇菌絲體比較松散,存在藍黑色的脂肪粒,但是數(shù)量不多。第10天菌絲體形態(tài)清晰且比第4天
48、的菌絲體變得更加緊密,同時有很多紫黑色的脂肪粒存在。第16天的菌絲體內同樣有許多脂肪粒存在,但是較10天略微減少。由此,我們可以定性地判斷平菇菌絲體生長過程中存在脂肪的合成,且可以粗略地判斷脂肪含量先增加后減少,這與定量測定脂肪含量所呈現(xiàn)的結果是一樣的。</p><p> 圖5 平菇菌絲體內脂肪染色情況(1600×)</p><p> 綜上所述,平菇菌絲體隨實驗時間的推移呈現(xiàn)
49、先增加后減少的規(guī)律。平菇菌絲體經蘇丹黑B染色,在顯微鏡下可以清晰地觀察到一顆顆藍灰色的脂肪粒,定性地證明了平菇菌絲體生長過程中存在脂肪合成現(xiàn)象。然后,通過酸熱法測定,發(fā)現(xiàn)菌絲體內脂肪隨著實驗時間推移出現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象,當培養(yǎng)時間到第10天時,脂肪含量達到最高值4.16%,后來由于培養(yǎng)基內營養(yǎng)元素不足,菌絲體消耗自身物質,導致脂肪含量下降。</p><p> 4.2 營養(yǎng)因子對平菇產脂影響的分析</p&
50、gt;<p> 4.2.1 Plackett-Burman法篩選影響培養(yǎng)基的主要因素</p><p> 本文根據(jù)對平菇的研究,選用實驗次數(shù)N=12的實驗設計,對葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2這5個因素進行考察,每個因素分別取低水平(-1)和高水平(+1)2個水平,每個因素的濃度用g/L表示,響應值為油脂產率(Y),單位為%。平行實驗4次,具體實驗設計和
51、實驗結果見表6、表7。</p><p> 表6 Plackett-Burman實驗設計與響應值變化(N=12)</p><p> 表7 Plackett-Burman實驗結果</p><p> 通過Minitab 軟件對所得實驗數(shù)據(jù)分析,獲得多元一次回歸方程:y = 9.03 + 0.0740 A - 1.36 B - 1.37 C - 0.637 D - 1
52、1.6 E。式中A、B、C、D、E分別代表葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2。</p><p> 由表7可以看出該回歸模型的P值為0.001(P<0.005),說明該模型顯著即該模型在被研究的整個回歸區(qū)域擬合良好。其次葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4這3個因素對平菇的脂肪含量影響最大,且葡萄糖對提高培養(yǎng)基內脂肪含量具有顯著正效應,酒石酸銨、KH2PO4、MgSO4
53、183;7H2O、CaCl2具有負效應。按照影響的大小,各因素順序依次為KH2PO4、酒石酸銨、葡萄糖、MgSO4·7H2O、CaCl2。其中CaCl2對結果的影響最小,MgSO4·7H2O對結果影響較大,KH2PO4、酒石酸銨、葡萄糖對結果影響最大。</p><p> 4.2.2 最陡爬坡實驗(Steepest ascent design)確定因素水平</p><p&g
54、t; 由Plackett-Burman實驗的結果選取葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4這3個對脂肪含量影響最顯著的因素進行最陡爬坡實驗。根據(jù)這3因素的效應大小比較設定它們的變化方向和步長,由于葡萄糖對平菇菌絲體中脂肪含量的影響呈正效應,而酒石酸銨、KH2PO4呈現(xiàn)負效應,因此葡萄糖的量要依次減少,而酒石酸銨、KH2PO4的量要依次增加。依此,葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4這3個濃度的步長分別取取-5,0.2,0.1,具體情況如表8所示。&
55、lt;/p><p> 表8 最陡爬坡實驗設計及結果</p><p> 由表8可見,脂肪含量從上到下先增加后降低,呈現(xiàn)一個開口向下的拋物線形狀,存在最大值即葡萄糖為10g/L、酒石酸銨為0.821 g/L和KH2PO4為0.8 g/L。故以第4組的實驗條件為響應面實驗因素水平的中心點。</p><p> 4.2.3 Box-Benhnken實驗確定主要因素的最優(yōu)水平
56、</p><p> 根據(jù)最陡爬坡實驗所得的最優(yōu)組,確定Box-Benhnken Design實驗的因素與水平,進行實驗。通過Design Expert軟件對平菇菌絲體內脂肪含量的測定結果進行統(tǒng)計分析后,其具體實驗設計及實驗結果見表9、表10。實驗因子對響應值的影響可用以下回歸方程表示:Y=-107.20595+0.31819A+172.0750B+108.81562C</p><p>
57、 +0.29375AB-0.12500AC+11.56250BC-0.024531A2-113.00000B2-68.35937C2。式子中A、B、C分別代表葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4。</p><p> 據(jù)表10可知此模型P值小于0.0001,失擬性P值0.4064>0.05,說明此模型在α=0.05水平上失擬不顯著,回歸高度顯著?;貧w模型的R2為0.9800,說明該模型能夠解釋98.00%的變化,
58、擬合程度較好。此外,該模型的校正決定系數(shù)R2adj=0.9543,說明該模型與實際擬合良好,可以用于培養(yǎng)基對脂肪含量影響的分析。</p><p> 表9 響應面Box-Behnken實驗設計及實驗結果</p><p> 表10 Box-Benhnken Design實驗回歸模型方差分析表</p><p> 圖6 響應面法立體分析圖和相應等高線圖</p&g
59、t;<p> 其中6-1是當KH2PO4=0.80g/L時,葡萄糖和酒石酸銨對脂肪含量的交互影響。6-2是當酒石酸銨=0.82g/L時,葡萄糖與KH2PO4對脂肪含量的交互影響。6-3是當葡萄糖=10g/L時,酒石酸銨和KH2PO4對脂肪含量的交互影響。</p><p> 根據(jù)上述回歸方程及回歸模型方差分析表繪出雙因子效應分析圖見圖6。由響應面曲線圖6-1可見,當葡萄糖濃度一定時,脂肪含量隨著酒
60、石酸銨的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,曲線變化明顯。當酒石酸銨濃度一定時,脂肪含量隨著葡萄糖的增加先增加后減少。由響應面曲線圖6-2可見,當葡萄糖濃度一定時,KH2PO4逐漸上升,對應的脂肪含量先增加后降低,增加程度較大,而后慢慢下降,下降程度不高,說明脂肪含量在KH2PO4為較大值時達到最高值。當KH2PO4濃度一定時,脂肪含量隨著葡萄糖增加先上升后下降,變化不明顯。由響應面曲線圖6-3可見,當酒石酸銨濃度一定時,隨著KH2PO4濃度的
61、上升,脂肪含量先增加然后再減少,曲線變化明顯,當KH2PO4一定時,脂肪含量隨著酒石酸銨的上升先增加后減少,曲線變化較明顯。等高線呈圓形說明兩因素交互作用不顯著,呈橢圓或者馬鞍形則表明作用顯著,而圖中顯示的3個等高線為橢圓或馬鞍形狀,說明兩因素之間交互顯著,且反應的結果均與回歸模型方差分析表一致。</p><p> 根據(jù)表10和圖6可見,影響平菇產脂的主要因素為KH2PO4,次要因素為酒石酸銨和葡萄糖。KH2P
62、O4作為無機鹽,適當?shù)丶尤肱囵B(yǎng)基內能夠促進平菇菌絲體內脂肪的合成和積累。這個與國外學者研究構巢曲霉發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中適當調整Na+、K+、Mg2 +、SO42 -、PO43 -等離子的含量比,提高菌體油脂含量[29]相符合。同時KH2PO4可以作為緩沖液,使菌絲體處在最佳的pH環(huán)境。酒石酸銨作為一種無機氮源,有利于不飽和脂肪酸的合成和積累。根據(jù)所得實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在一定范圍內,脂肪含量隨著氮源增加而增加,且酒石酸銨為0.82g時,脂肪含量達到最
63、高值。可見平菇菌絲體對氮源需求高,在較高氮源情況下平菇菌絲體才能良好地生長、更好地進行脂肪的合成和積累。葡萄糖被研究為是菌絲體細胞生長的最佳碳源,同時也是菌體油脂合成的最適碳源[29]。平菇脂肪含量隨著葡萄糖增加先增高后減少,在9.2g時達到最高值。此后油脂含量逐漸減少,是因為葡萄糖濃度過高會導致菌體自身的代謝異常旺盛,細胞內產生大量的有機酸,影響到微環(huán)境的pH以及葡萄糖的代謝產物抑制其他產物的合成。另外從C/N比來看,不同的碳氮比對真
64、菌油脂的合成和積累有顯著</p><p> 綜上所述,可以確定KH2PO4對平菇菌絲體脂肪含量的影響具有顯著性,酒石酸銨、葡萄糖次之。通過Design-Expert軟件分析得出當葡萄糖9.2g、酒石酸銨0.82g、KH2PO40.86g時,理論上可獲得最高脂肪含量11.36%,生物量為0.3315g。</p><p><b> 5 討論</b></p>
65、<p> 本實驗主要研究平菇生長過程中的脂肪規(guī)律,發(fā)現(xiàn)脂肪含量隨著時間的增長先增加后減少。影響脂肪含量的因素多且復雜,本實驗操作過程中溫度、pH、濕度基本保持不變,下面將從菌體培養(yǎng)時間、細胞密度這兩方面進行討論。在菌絲體脂肪含量變化中,細胞合成油脂的最佳時間與菌種所處生長階段和培養(yǎng)時間都有關系。時間過短,真菌油脂還沒有完全形成,時間過長,導致菌體細胞自溶或菌絲體不再形成,只有在適宜的培養(yǎng)時間內,才能達到最佳的產油脂狀態(tài)。
66、通過實驗,我們了解到平菇菌絲體在前十天(生長對數(shù)期)油脂含量急劇增加,在第10天(對數(shù)期中后期)脂肪含量達到最大值,第10天以后(穩(wěn)定期)脂肪含量逐漸下降。因此,我們可以通過觀察菌絲體的生長狀態(tài)判斷所處生長階段,然后可以粗略判斷脂肪含量。細胞密度一定程度上也對脂肪含量產生影響,適當?shù)脑黾蛹毎芏瓤梢蕴岣哂椭暮?,密度過高則會影響油脂產率[30]。在植菌的時候,我們通常使用已滅菌地直徑1㎝的打孔器和刮刀在超凈臺內將菌塊植入到培養(yǎng)瓶內,菌
67、塊的大小決定了細胞密度。那么如果適當改變實驗所需的打孔器的直徑,平菇油脂產率應該也會有所影響。適當?shù)木鷫K大小不僅可以提高油脂產量,而且減少雜菌污染</p><p> 此外,通過對比生物量和脂肪含量的折線圖(圖7),發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的前10天,平菇菌絲體的生物量和脂肪含量均呈上升趨勢,脂肪含量在第10天達到最高值,然后第10~16天,生物量繼續(xù)上升,并達到最大值,與此同時脂肪含量開始降低。第16天之后,生物量開始減少,不
68、過減少程度很低而脂肪含量逐漸趨于平衡。剛開始平菇菌絲體利用培養(yǎng)基內豐富的營養(yǎng)元素進行細胞增殖和脂肪的合成與積累,導致生物量和脂肪含量快速上升。中期由于培養(yǎng)基內營養(yǎng)不足,菌絲體開始消耗自身體內油脂維持菌絲體生長,導致脂肪含量緩慢下降。最后,由于空間有限和能源的不足,菌絲體停止增長,脂肪含量基本達到穩(wěn)定狀態(tài)。第16天以后生物量減少可能是因為培養(yǎng)時間過長,細胞變形,并且出現(xiàn)自溶現(xiàn)象[21]。</p><p> 圖7
69、生物量和脂肪含量的變化圖</p><p><b> 6 結論</b></p><p> 本實驗采用液體培養(yǎng)法,在Kirk培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)平菇菌絲體。隨著培養(yǎng)時間的增加平菇菌絲體出現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象,并且在第16天的時候,菌絲體達到最高值。此外,采用蘇丹黑B染色法對平菇菌絲體進行染色,顯微鏡下發(fā)現(xiàn)數(shù)量較多的藍紫色或藍黑色的形態(tài)分明的脂肪粒存在。另一方面采用酸熱法定
70、量測定脂肪含量,結果表明脂肪含量先增加后減少最后趨于平穩(wěn),且在培養(yǎng)的第10天時,脂肪含量達到最大值。平菇培養(yǎng)基中的脂肪含量有大有小,數(shù)據(jù)散亂,無一定的規(guī)律性,可見培養(yǎng)基中的脂肪含量有待進一步研究。</p><p> 接下來依次使用PB實驗設計、最陡爬坡實驗以及Box-Benhnken 實驗設計確定最優(yōu)培養(yǎng)基。由表8和三維分析圖可以看出對平菇菌絲體產脂影響大小依次為KH2PO4、酒石酸銨、葡萄糖。通過Box-Be
71、nhnken Design 軟件對數(shù)據(jù)分析得出當葡萄糖9.2g/L、酒石酸銨0.82g/L、KH2PO40.86g/L時,理論上可獲得最高脂肪含量11.36%。通過本實驗,對于控制在白腐真菌處理有機固廢后的菌糠中的脂肪含量奠定了一定的實驗基礎。</p><p><b> 參考文獻</b></p><p> [1] 張愛武,董 斌,康 偉.白腐真菌對秸稈的降解效果及
72、影響因素[J].飼料研究,2011(5):15-17.</p><p> [2] 石晶晶,武 智,李朝霞.白腐真菌處理工業(yè)廢水的研究進展[J].河北化工,2009,32(7):36-37.</p><p> [3] 金 科,李小明,楊麒.龍文芳.白腐真菌吸附廢水中重金屬離子的研究進展[J].工業(yè)用水與廢水,2005(2):15-18.</p><p> [4]
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87、文,胡老師都給予了我極大的幫助。在實驗方面,老師給了我很多的指導,讓我以應有的專業(yè)素養(yǎng)認真對待實驗。當我在寫論文遇到麻煩時,胡老師給我理清思路,指明方向。在論文指導過程中,可以深刻地感受到胡老師對工作認真、負責、嚴謹?shù)膽B(tài)度。他的這些精神深深地影響著我,將使我受益終身。在此,特向胡老師致以我最衷心的謝意。其次,我還要感謝那些和我一起做實驗的同學,感謝他們平時對我的關心和幫助,有了他們我的實驗生活變得更加的豐富多彩,這些將是我人生中美好的回
88、憶。</p><p> 最后,我要對四年相處過的同學和教育過我的老師表示感謝,有了你們我的大學生活變得美好。同時向參加論文評閱、評議及答辯組的老師們,致以誠摯的謝意!</p><p> 附錄3 脂肪的國標測定方法</p><p> 脂肪測定的國標規(guī)定方法 GB/T 5009.6-2003</p><p><b> 原理<
89、;/b></p><p> 試樣經酸水解后用乙醚提取,除去溶劑即得總脂肪含量,酸水解法測得的為游離及結合脂肪的總量。</p><p><b> 試劑</b></p><p><b> 1 鹽酸。</b></p><p> 2 乙醇(95%)。</p><p>&
90、lt;b> 3 乙醚。</b></p><p> 4 石油醚(30℃~60℃沸程)。</p><p><b> 儀器</b></p><p> 100mL具塞刻度量筒。</p><p><b> 分析步驟</b></p><p> 1 按以下方法
91、進行試樣處理</p><p> 1.1 固體試樣:稱取約2.00g的試樣置于50mL大試管內,加8mL水,混勻后再加10mL鹽酸。</p><p> 1.2 液體試樣:稱取10.00g,置于50mL大試管內,加10mL鹽酸。</p><p> 2 將試管放入70℃~80℃水浴中,每隔5min~10min以玻璃棒攪拌一次,至試樣消化完全為止,約40min~50m
92、in。</p><p> 3 取出試管,加入10mL乙醇,混合。冷卻后將混合物移入100mL具塞量筒中,以25mL乙醚分次洗試管,一并倒入量筒中。待乙醚全部倒入量筒后,加塞振搖1min,小心開塞,放出氣體,再塞好,靜置12min,小心開塞,并用石油醚-乙醚等量混合液沖洗塞及筒口附著的脂肪。靜置10min~20min,待上部液體清晰,吸出上清液于已恒量的錐形瓶內,再加5mL乙醚于具塞量筒內,振搖,靜置后,仍將上層
93、乙醚吸出,放入原錐形瓶內。將錐形瓶置水浴鍋上蒸干,置100℃±5℃烘箱中干燥2h,取出放干燥器內冷卻0.5h后稱量,重復以上操作直至恒量。</p><p><b> 計算</b></p><p><b> 式中:</b></p><p> ——試樣中粗脂肪的含量,單位為克每百克(g/100g);</p
94、><p> ——接收瓶和粗脂肪的質量,單位為克(g);</p><p> ——接收瓶的質量,單位為克(g);</p><p> ——試樣的質量(如是測定水分后的試樣,則按測定水分前的質量計),單位為克(g);</p><p> 計算結果表示到小數(shù)點后一位。</p><p><b> 精密度</b&
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