橘子及其加工制品中的赤霉素檢測【開題報告+文獻綜述+畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　食品質(zhì)量與安全</b></p><p>　　橘子及其加工制品中的赤霉素檢測</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><

2、p>　　赤霉素是一種廣譜性植物生長調(diào)節(jié)劑，幾乎在植物生長、發(fā)育的各個階段都起著調(diào)節(jié)作用。自1935年日本科學家從水稻赤霉菌中分離出一種活性制品，并得到結(jié)晶，定名為赤霉素（GA）以來，目前已從高等植物和微生物中分離出70余種赤霉素。赤霉素是植物的四大類激素之一，廣泛地存在于植物組織中。橘子(Citrus)，蕓香科，柑橘屬，原產(chǎn)地中國。在我國栽培橘子已經(jīng)有4000多年歷史，而且分布十分廣泛。我國生產(chǎn)柑橘包括臺灣省在內(nèi)有19個省(市、自

3、治區(qū))，種植的縣(市、區(qū))有985個。柑橘果實營養(yǎng)豐富，胡蘿卜素(維生素A原)含量僅次于杏，比其他水果都高。除含多種維生素外，還含鎂、硫、鈉、氯和硅等元素。同時，它色香味兼優(yōu)，既可鮮食，又可加工成以果汁為主的各種加工制品，廣受消費者的青睞。世界有135個國家生產(chǎn)柑橘，年產(chǎn)量10282.2萬噸，面積10730萬畝，均居百果之首。我國水果總產(chǎn)量5000萬噸，位居世界首位，但出口量僅為16萬噸，占世界水果出口總量的3%。</p>

4、<p>　　中國加入世界貿(mào)易組織后，我國對外貿(mào)易的國際環(huán)境得到較大改善。然而，我國的農(nóng)產(chǎn)品出口并沒有因此而大幅度提高，直接原因是農(nóng)殘超標，檢驗檢疫方面不過關(guān)。根據(jù)日本肯定列表最終數(shù)據(jù)查詢  (2006年5月29日起實施)暫定 菠菜、菠蘿、草菇、草莓、橙(包括臍橙)、蔥(包括韭蔥) 大白菜、大蒜、豆瓣菜、鱷梨、番木瓜、番茄、番石榴、繁殖洋蔥等使用的最高限量MRL為0.2 ppm；美國(USA )允

5、許蘋果中的農(nóng)藥殘留限量要求（1999年3月15日）聯(lián)邦法律條款（40 CFR 120）赤霉素殘留限量（Tolerance, ppm）為0.5。然而據(jù)相關(guān)資料顯示，我國現(xiàn)在對于赤霉素檢測的標準只有兩個：SN 0350-1995出口水果中赤霉素殘留量檢驗方法（行業(yè)標準）和DB11/ T 379-2006 豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉 6-芐基腺嘌呤、 2,4-滴、赤霉素、福美雙的測定（北京地方標準）。由此可見我國產(chǎn)品標準的制定與國際標準和國外先進

6、標準差距較大。同時，檢驗檢疫實驗室作為技術(shù)執(zhí)法的主體，檢測力量不足，檢測技術(shù)和方法落后，不僅嚴重阻礙中國農(nóng)產(chǎn)品的出口，而且造成控制產(chǎn)品質(zhì)量上的空缺，使我國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量難以與國際</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p><b>　　基本內(nèi)容：</b></p><p>　　以橘子及其加工制品（如橘子罐頭等）中的赤霉

7、素為研究對象，采用SPE固相萃取結(jié)合高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用儀等方法，對橘子及其加工制品中的赤霉素的檢測進行研究，并優(yōu)化其條件。</p><p>　　1、篩選適合樣品（橘子及其加工制品）的前處理方法；</p><p>　　2、采用色譜分析方法，對橘子及其加工制品中的赤霉素進行檢測，優(yōu)化分析條件；</p><p>　　3、建立相關(guān)的檢測方法，并明確相關(guān)檢測方法的回收率、

8、檢測限等。</p><p><b>　　擬解決的問題：</b></p><p>　　1、樣品中赤霉素提取溶劑的選擇；</p><p>　　2、篩選出樣品中赤霉素濃縮和凈化的前處理方法；</p><p>　　3、固相萃取（SPE）與高效液相色譜檢測路線的條件優(yōu)化；</p><p>　　4、色譜條件對

9、于標準品檢出的影響，確定優(yōu)化的色譜條件。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p><b>　　1、資料檢索：</b></p><p>　　以“赤霉素”、“GA3”、“高效液相”、“液質(zhì)聯(lián)用”、“氣相色譜”等為檢索詞，檢索中國期刊全文數(shù)據(jù)庫（1989－2010）、萬方數(shù)據(jù)庫（1989－2010）和維普數(shù)據(jù)庫（1989－20

10、10）等數(shù)據(jù)庫，以“gibberellin”、“GA3”、“HPLC” 、“LC-MS”等為關(guān)鍵詞檢索Science Director(1989,2010)，查找相關(guān)文獻。</p><p><b>　　優(yōu)化色譜條件：</b></p><p>　　采用高效液相色譜和LC-MS檢測器對標準樣品溶液進行檢測，分析得到赤霉素的保留時間。通過分析色譜圖，研究色譜條件的改變對標樣

11、檢測的影響。</p><p><b>　　篩選前處理方法：</b></p><p>　　根據(jù)相關(guān)文獻，采用SPE固體萃取柱將前處理后的樣品進行凈化，并通過色譜分析的結(jié)果篩選出適合樣品（橘子及其加工制品）的前處理方法。</p><p><b>　　建立檢測方法：</b></p><p>　　根據(jù)實際樣

12、品的色譜結(jié)果，進一步完善色譜條件等，建立相應(yīng)的檢測方法。并在此檢測方法下，確定赤霉素的檢出限，繪制標準曲線，計算RSD值等。</p><p><b>　　技術(shù)路線：</b></p><p>　　橘子及其制品中赤霉素的檢測</p><p>　　四、研究的總體安排與進度：</p><p>　　2009年9月—2010年11月

13、：</p><p>　　1、實驗前的準備工作：查找資料，文獻綜述的撰寫，英文參考文獻的翻譯；</p><p>　　2、文獻整理，實驗方案的確定，完成開題報告。</p><p>　　2010年10月—2011年３月：</p><p><b>　　1、開展實驗；</b></p><p>　　2、優(yōu)化實

14、驗方案中的各條件；</p><p>　　3、獲得實驗過程中的各類數(shù)據(jù)。</p><p>　　2011年3月—2011年5月：</p><p>　　1、整理和補充相關(guān)數(shù)據(jù)，整理實驗結(jié)果；</p><p><b>　　2、撰寫論文初稿；</b></p><p><b>　　3、論文定稿。&l

15、t;/b></p><p><b>　　五、主要參考文獻：</b></p><p>　　[1]中國農(nóng)科院植保研究所等編.農(nóng)藥分析,化學工業(yè)出版社,北京,1998.</p><p>　　[2]李金,石晶,趙曉亮等.分析化學，1994,22 (8):80 1-804.</p><p>　　[3]丁 靜,沈鎮(zhèn)德,方亦雄,

16、等. 植物內(nèi)源激素的提取分離和生物鑒定[J]. 植物生理學通訊,1979 ,5 (2) :28</p><p>　　[4]羅正榮,吳謀成,章文才. 植物組織中赤霉酸含量的高效液相色譜測定[J]. 植物生理學通訊, 1990 ,26 (2) :50-52.</p><p>　　[5]上海市“920”協(xié)作組.“九二○”的應(yīng)用和土法生產(chǎn)[M ]. 上海: 上海人民出版社, 1973.</p

17、><p>　　[6]印天壽, 陳世勇, 于群英, 等. 赤霉素的快速分光光度測定法的研究[J]. 分析化學, 1990, 18 (10) : 966- 969.</p><p>　　[7]中國科學院植物研究所、遺傳研究所“920” 編寫小組.“920”農(nóng)藥技術(shù)資料匯編.第l集.北京:科學出版社1970.</p><p>　　[8]陳玉鑾, 王占文, 孫思祥. 赤霉素的磷

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19、-39.</p><p>　　[11]Shengjie Hou, Jiang Zhu, Mingyu Dinga, et al.Simultaneous determination of gibberellic acid, indole-3-acetic acid and abscisic acid in wheat extracts by solid-phase extraction and liquid ch

20、romatography–electrospray tandem mass spectrometry[J].Talanta,2008(76):798–802.</p><p>　　[12]王 勇,程金芬.高效液相色譜法檢測赤霉素A3組份[J].中國抗生素雜志,1990,4:35-37.</p><p>　　[13]陳小鵬,王秀峰,孫小鐳,等.高效液相色譜測定黃瓜瓜條中赤霉素和脫落酸含量[J

21、].山東農(nóng)業(yè)科學,2005(1):65-67.</p><p>　　[14]唐根源,吳紅京.高效液相色譜法測定小麥幼苗中植物生長調(diào)節(jié)劑[J].分析試驗室,1997,16(5):66-69.</p><p>　　[15]朱智甲,郝振芳,張曉惠,等.高效液相色譜紫外檢測法測定小麥幼苗中的內(nèi)源激素[J].光譜實驗室,1999,16(3):281-283.</p><p>

22、　　[16]湛社霞,孫世宏,臧李納,等.高效液相色譜法測定水果中的赤霉素、苯甲酸、糖精鈉和胭脂紅[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2008,18(7):1330-1332.</p><p>　　[17]陳波浪,鄭春霞,盛建東,等.HPLC分離和測定棉花中3種植物激素[J].新疆農(nóng)業(yè)大學學報,2006,29(1):28-30.</p><p>　　[18]XIE JUN，ZHANG Yizheng.

23、 Determination of plant intrinsic hormones by reversed-phase high-performance liquid chromatography [J].Journal of Instrumenta1 Analysis.2001,1:60-62.</p><p>　　[19]WANG Ruozhong, XIAO Langtao, LAN Wanhuang,

24、et a1. High performance liquid chromatographic determination of internal hormones in inter-subspecific hybrid rice [J].Chinese．Journal of Chromatography.2002,2:148-157.</p><p>　　[20]張有林,黨 婭,張 靜,等.高效液相色譜法同時測

25、定銀鳳桃中的赤霉素和脫落酸[J].西北植物學報,2005,25(7):1467-1471.</p><p>　　[21]Grolamys Castillo , Servando Martinez. Reversed-phase C18 high-performance liquid chromatography of gibberellins GA3 and GA1[J].Journal of Chromatog

26、raphy A,1997, 782 (1):137-139.</p><p>　　[22]葛雅琨,張元新,胡 睿,等.蔬菜中赤霉素殘留量的高效液相色譜檢測方法研究[J].吉林化工學院學報,2005,22(2):13-16.</p><p>　　[23]張 政,張 強,王轉(zhuǎn)花.高效液相色譜法測定赤霉素A3的含量[J].色譜,1993,11(4):254-255.</p><

27、;p>　　[24]顧覺奮,王義明,劉文華.赤霉素A3的反相高壓液相色譜分析[J].中國抗生素雜志,1991,16(5):370-375.</p><p>　　[25]張玉宗,陳振玲,呂杏者,等.高效液相色譜法測定谷子幼苗中的GA1和GA3[J].色譜,1999,17(5):469-472.</p><p>　　[26]喬坤云,張 敏.高壓液相色譜測定新疆庫爾勒香梨中赤霉素(GA3)方

28、法研究[J].特產(chǎn)研究,2002(4):25-26.</p><p>　　[27]朱曙東,趙 琛,趙文君,等.反相高效液相色譜分析赤霉素GA3含量[J].藥學學報,1993,28(10):788-791.</p><p>　　[28]黃紅林,劉 實,張?zhí)抑?固相萃取一高效液相色譜測定番茄中的赤霉素GA3殘留[J].分析科學學報,2005,25(1):75-77.</p>&l

29、t;p>　　[29]付 磊,陶燕飛.氣相色譜法測定草莓中的赤霉素[J].武漢科技大學學報(自然科學版),2002,25(4):359-360.</p><p>　　[30]許慶琴，范哲鋒,杜黎明.大口徑毛細管氣相色譜法快速測定植物組織中的赤霉素[J].分析科學學報，2000,16(6):524.</p><p>　　[31]黃紅林,張?zhí)抑?劉 實,等.SPE—GC—MS選擇離子法直

30、接測定果品中赤霉素殘留量[J].理化檢驗-化學分冊,2006,3:194-196.</p><p>　　[32]馬煥普.用GC—MS檢測蘋果種子層積過程中內(nèi)源MeJA,GA3,GA4和GA7的變化[J].植物生理學報,1996,22(1):81-88.</p><p>　　[33]吳 萍,劉 玲.芥藍未熟種子赤霉素的GC／MS定性分析[J].質(zhì)譜學報,1997,18(2):67-76.&l

31、t;/p><p>　　[34]梁 沛,張?zhí)抑?黃紅林.固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定水果中的赤霉素GA3殘留[J].第四屆海峽兩岸分析化學學術(shù)會議論文集,2006(11):68-69.</p><p>　　[35]劉艷琴,王浩,楊紅梅,等.高效液相色譜一串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用測定水果和蔬菜中赤霉素殘留量[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2009(16):330-331.</p><p&g

32、t;　　[36]王 駿,張 卉,胡 梅,等.液相色譜一質(zhì)譜測定獼猴桃中赤霉素和脫落酸的含量[J].食品工業(yè),2008(4):74-76.</p><p>　　[37]Shengjie Hou, Jiang Zhu, Mingyu Dinga,et al. Simultaneous determination of gibberellic acid, indole-3-acetic acid and abscisi

33、c acid in wheat extracts by solid-phase extraction and liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry[J].Talanta,2008(76):798–802.</p><p>　　[38]何解定.中國突破農(nóng)產(chǎn)品出口技術(shù)壁壘的對策研究[J].社會縱橫,2009,24(14):28-29.&

34、lt;/p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　食品質(zhì)量與安全</b></p><p>　　果蔬中赤霉素檢測方法的研究現(xiàn)狀</p><p>　　摘 要：赤霉素是廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)各領(lǐng)域的一種植物激素，其殘留過量則會對人體造成危害。目前我國還沒有建立關(guān)于赤霉素的國

35、際標準。本文介紹了我國果蔬出口國的赤霉素含量的要求，分析了傳統(tǒng)檢測赤霉素方法的缺點，并重點介紹了目前用于果蔬中赤霉素的檢測方法及其研究現(xiàn)狀。</p><p>　　關(guān)鍵詞：赤霉素；檢測；高效液相色譜</p><p>　　赤霉素是一種廣譜性植物生長調(diào)節(jié)劑，幾乎在植物生長、發(fā)育的各個階段都起著調(diào)節(jié)作用。赤霉素在植物體內(nèi)的形成部位一般是嫩葉、芽、幼根以及未成熟的種子等幼嫩組織。1926年日本病理學

36、家黑澤在水稻惡苗病的研究中發(fā)現(xiàn)水稻植株發(fā)生徒長是由赤霉菌的分泌物所引起的。1935年日本藪田從水稻赤霉菌中分離出一種活性制品，并得到結(jié)晶，定名為赤霉素（GA）。第一種被分離鑒定的赤霉素稱為赤霉酸（GA3），現(xiàn)已從高等植物和微生物中分離出70余種赤霉素。</p><p>　　圖1 赤霉素的結(jié)構(gòu)圖</p><p>　　赤霉素中生理活性最強、研究最多的是GA3。它能顯著地促進植物莖、葉生長，特別

37、是對遺傳型和生理型的矮生植物有明顯的促進作用；能代替某些種子萌發(fā)所需要的光照和低溫條件，從而促進發(fā)芽；可使長日照植物在短日照條件下開花，縮短生活周期；能誘導(dǎo)開花，增加瓜類的雄花數(shù)，誘導(dǎo)單性結(jié)實，提高坐果率，促進果實生長，延緩果實衰老。除此之外，GA3還可用于防止果皮腐爛；在棉花盛花期噴灑能減少蕾鈴脫落；馬鈴薯浸種可打破休眠；大麥浸種可提高麥芽糖產(chǎn)量等等。 </p><p>　　赤霉素作用廣泛[1,2]，但屬

38、于低毒植物生長調(diào)節(jié)劑，當大量使用時會產(chǎn)生一定毒性。我國目前還沒有相關(guān)的國家標準，有必要建立高靈敏、快速的赤霉素殘留檢測方法。</p><p>　　1 國內(nèi)外赤霉素限量要求</p><p>　　根據(jù)日本肯定列表最終數(shù)據(jù)查詢  (2006年5月29日起實施) 暫定 菠菜、菠蘿、草菇、草莓、橙(包括臍橙)、蔥(包括韭蔥) 大白菜、大蒜、豆瓣菜、鱷梨、番木瓜、番茄、番

39、石榴、繁殖洋蔥等使用的最高限量MRL為0.2 ppm。美國(USA )允許蘋果中的農(nóng)藥殘留限量要求（1999年3月15日）聯(lián)邦法律條款（40 CFR 120）赤霉素殘留限量（Tolerance, ppm）為0.5。中國臺灣2007年2月1日公布了有關(guān)食品內(nèi)殺蟲劑殘留限量草案以及擬撤消殺蟲劑最大殘留限量(MRLs)遺漏名單中的殺蟲劑，草案對芹菜內(nèi)的赤霉素(gibberellicacid)也規(guī)定了最大殘留限量。</p><

40、;p>　　在國內(nèi)關(guān)于赤霉素檢測的標準有以下兩個：①SN 0350-1995出口水果中赤霉素殘留量檢驗方法（Method for the determination of gibberellic acid residues in fruits for export），此為行業(yè)標準，主要采用方法為熒光分光光度計法；②DB11/ T 379-2006 豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤、2,4-滴、赤霉素、福美雙的測定，此為北京地方

41、標準，主要采用方法為HPLC-DAD法。但是，目前還未建立相關(guān)的國家標準。</p><p>　　2 果蔬中赤霉素的檢測方法</p><p>　　赤霉素的測定方法主要有三大類：生物鑒定法、免疫法和物理化學法。生物鑒定法靈敏度雖高，但準確度不很好，且操作費時[3]；免疫法的準確度和靈敏度很高，但因制備抗體復(fù)雜而難以推廣[4]。常見的理化測定法主要有熒光比色法、紫外分光光度法、溴酸鉀滴定法[5]

42、、福林反應(yīng)法[6]、2,4-二硝基苯肼比色法[7]、磷鉬雜多酸法[8]等。熒光法[9,10]是GA測定的經(jīng)典方法，但該法操作過繁，試劑消耗量大，且需要真空泵及冰浴等條件；紫外分光光度法的準確度都易受雜質(zhì)的干擾而降低；溴酸鉀滴定法選擇性較差，不能用于發(fā)酵液中赤霉素測定。而且這些方法都只能檢測同系混合物的總量，不能分辨各有效成分，尤其是GA3含量，因此不符合檢驗標準，特別是不能滿足出口檢驗要求。</p><p>　　

43、隨著色譜儀、質(zhì)譜儀的出現(xiàn)，很大程度上解決了這一大難題。質(zhì)譜分析儀具有高靈敏度和選擇性，因此是檢測植物激素最有效的檢測器。最近幾年，LC–ESI-MS/MS已被用于檢測植物樣品中的IAA和ABA，但是被用于檢測GA3的報道比較少[11]。國內(nèi)外對果蔬原料中的赤霉素進行定性和定量的研究常采用HPLC法、GC-MS法、LC-MS法等方法。</p><p>　　2.1 高效液相色譜法</p><p&g

44、t;　　高效液相色譜是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法。在70年代末，高效液相色譜開始逐步用于檢測除乙烯以外的植物激素。國外研究者那時也開始研究用高效液相色譜儀來分離檢測赤霉素組份的含量了。Reeve等人在把赤霉素各組份的羧基酯化后，再用高效液相色儀來分離其酯化衍生物。Lin J.T.等則是用反相高效液相色譜技術(shù)來直接分離赤霉素各組份。實驗證明[12]高效液相色譜對赤霉素的定性、定量測量是準確可靠的。</p><p>

45、　　目前，HPLC應(yīng)用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個領(lǐng)域。高效液相色譜測定植物樣品中內(nèi)源激素含量時，經(jīng)常見到分離效果差、峰形不良及嚴重拖尾現(xiàn)象，這些都與流動相、流速、檢測器種類和檢測波長關(guān)系很大，因此選擇合適的內(nèi)源激素提取方法和色譜條件較為重要[13]。</p><p>　　赤霉素是重要的內(nèi)源性激素之一，在植物中的含量較少，為方便檢測，很多研究建立同時檢測植物中多種激素的方法。唐根源[14]和朱智甲[15]

46、等人均采用用反相高效液相色譜紫外檢測法來測定麥苗中激素的含量，選擇最佳色譜條件顯儀器參數(shù)，建立了相應(yīng)的檢測法。湛社霞等人[16]研究并建立高效液相色譜法測定水果中赤霉素、苯甲酸、糖精鈉和胭脂紅含量的方法。陳波浪等[17]采用高效液相色譜法(HPLC)測定棉花體內(nèi)吲哚3-乙酸(IAA)、玉米索(Z)和赤霉素(GA3)。但是同時檢測多種植物激素不能獲得每種植物激素的詳細信息，同時，隨著貿(mào)易問題的加劇，建立特定植物激素在植物中的定性和定量方法

47、也顯得越來越重要。</p><p>　　通過改變色譜條件及適當?shù)那疤幚矸椒?，可以使植物?nèi)源性激素的有效分離，從而建立單獨檢測果蔬中赤霉素的HPLC方法。高效液相色譜法(HPLC)具有靈敏度高、專一性強和重復(fù)性好等特點，謝君[18]曾采用HPLC 內(nèi)標法測定GA3和ABA，但內(nèi)標物必須具有和測定物相似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，因而確定內(nèi)標物難度較大。但是由于赤霉素在植物中的含量較少，因此前處理很關(guān)鍵。王若仲等[19]用HPLC

48、測定GA3和ABA，在樣品提取過程中要連續(xù)經(jīng)過3種分離柱(PVPP，DEAE，Sep-Pak C18)，前處理十分復(fù)雜。對此，張有林等[20]采用HPLC外標法同時分離和測定GA3和ABA，前處理簡單，所測成分損失少，靈敏度高，并具有較高的回收率和精密度。而Grolamys Castillo和Servando Martinez[21]則采用反相C18高效液相色譜法，建立了赤霉素GA3和GA1的檢測方法。葛雅琨等[22]使用高效液相色譜(

49、HPLC)對蔬菜中的農(nóng)藥GA3殘留進行分析檢測，建立了液液萃取與SPE-PAK C18固相萃取相結(jié)合純化GA3的方法。通過不同的加標方式及優(yōu)化前處理和檢測方法，可以有效地提高赤霉素的分</p><p>　　目前在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的108種赤霉素中，A1（GA1）和赤霉素A3（GA3）是影響植物株高的主要因素，一般常以生理活性最強的GA3作為檢測指標。GA1和GA3的結(jié)構(gòu)類似且各自的質(zhì)量比很低，檢測起來很困難，曾經(jīng)通用

50、一時的熒光比色法、碘量法等都只能測出赤霉素總含量，而不能測出各個成分的含量。對此，張政等[23]采用反相HPLC方法，實現(xiàn)了農(nóng)用赤霉素各組分較好地分開。赤霉索A3為極性物質(zhì)，發(fā)酵液中一些雜質(zhì)為非極性物質(zhì)，顧覺奮等[24]針對赤霉素的這個特點，采用用反相色譜柱，就使赤霉素的色譜峰出現(xiàn)較早，這樣既節(jié)省了實驗時間。張玉宗等[25]研究發(fā)現(xiàn)采用價格便宜的甲醇-磷酸鹽緩沖液為流動相，10Min內(nèi)實現(xiàn)了GA1和GA3的分離。喬坤云等[26]也通過優(yōu)

51、化色譜條件和色譜參數(shù)，建立了新疆庫爾勒香梨中赤霉素（GA3）高壓液相色譜的測定方法。</p><p>　　高效液相色譜除了可以有效地分離植物內(nèi)的各個赤霉素同系物，同時還可以用于赤霉素的定量檢測。朱曙東等[27]在研究赤霉素的定量檢測方法時，運用RP-HPLC成功地將GA3與其它組分分離，建立了精確測定GA3含量的新方法。其優(yōu)越性全面超出各傳統(tǒng)分析方法，可望成為赤霉素質(zhì)量分析的標準方法。黃紅林等[28]研究建立了固

52、相萃取-高效液相色譜(SPE-HPLC)法來分析測定番茄中赤霉素GA3殘留量。</p><p>　　2.2 GC 和GC-MS法</p><p>　　近年來，質(zhì)譜儀的出現(xiàn)為檢測果蔬中的赤霉素創(chuàng)造了條件。采用GC和GC—MS等儀器進行分析檢測，靈敏度高，重復(fù)性好，尤其適用于痕量植物樣品的測定。</p><p>　　氣相色譜常被用于檢測植物果蔬中的各種農(nóng)藥殘留，特別適用

53、于揮發(fā)性的物質(zhì)的檢測。付磊[29]研究草莓中外源植物激素GA3時采用氣相色譜進行檢測分析，建立了一種采用530μm大口徑毛細管色譜柱、不經(jīng)衍生化處理而直接測定植物生長素GA3的氣相色譜方法。許慶琴等[30]對不同固定相的大口徑毛細管柱進行了考察，發(fā)現(xiàn)赤霉素在非極性固定相毛細管柱中不僅靈敏度高、出峰速度快，而且重現(xiàn)性好。采用太口徑毛細管色譜柱，無需衍生化處理，直接進樣測定樣品中赤霉素含量結(jié)果令人滿意。</p><p&g

54、t;　　為了更加準確地對赤霉素進行定性分析，很多研究中往往采用靈敏度高、檢測限較低的質(zhì)譜儀，特別能適用于在植物中含量本身就比較微量的赤霉素。黃紅林等[31]采用固相萃取代替?zhèn)鹘y(tǒng)的液液萃取，研究了樣品在C18萃取柱上的保留行為，純化效果顯著。采用HP-1的色譜柱，無需柱前衍生化，直接進樣GC-MS測定，選擇離子監(jiān)測(SIM)克服了樣品基體干擾，靈敏度較全譜掃描高。并建立了固相萃氣相色譜質(zhì)譜選擇離子(SPE-GC-MSIM)直接分析果品中赤

55、霉素(GA3)殘留量的方法。馬煥普[32]已將GC-MS方法用于檢測蘋果種子層積過程中GA7的變化，并獲得了相關(guān)的檢測數(shù)據(jù)。</p><p>　　GAs的結(jié)構(gòu)具有較多的相似之處，用常規(guī)的理化分析方法很難將每一種GA進行有效的分離及定性分析，而質(zhì)譜儀則可以通過對GAs的定性分析，找到特征GAs，繼而進行更深入的研究工作。吳萍等[33]先借助生物試法對芥藍中的赤霉素進行必要的分離純化，并采用質(zhì)譜法進行檢測，從而實現(xiàn)了

56、對芥藍種子中GAs的定性、定量分析。 </p><p>　　2.3 LC-MS法</p><p>　　隨著聯(lián)用技術(shù)的日趨完善，HPLC-MS逐漸成為最熱門的分析手段之一。HPLC -MS作為已經(jīng)比較成熟的技術(shù)，目前己在生化分析、天然產(chǎn)物分析、藥物和保健食品分析以及環(huán)境污染物分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。利用HPLC-MS分析混合樣品，和其他方法相比具有高效快速，靈敏度高，只需品進行簡

57、單預(yù)處理或衍生化，尤其適用于含量少、不易分離得到或在分離過程中易的組分。</p><p>　　梁沛等[34]采用固相萃取技術(shù)對樣品進行處理，以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜為檢測手段，建立了測定水果中赤霉素GA3殘留的新方法，可以為確定赤霉素殘留標準提供實驗依據(jù)。劉艷琴等[35]也采用高效液相色譜一串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)來測定水果和蔬菜中赤霉素，并建立了相關(guān)的檢測方法。該法具有樣品處理簡單、測定周期短等優(yōu)點，適用于大量樣品的快速篩選

58、、測定。王駿等[36]建立用HPLC-MS測定獼猴桃中赤霉素和脫落酸殘留量的方法。盛杰厚等[37]則是采用固相萃取和液質(zhì)聯(lián)用儀，同時檢測小麥種的赤霉素、吲哚乙酸和脫落酸，并獲得了較高的回收率。</p><p><b>　　3 總結(jié)與展望</b></p><p>　　我國是果蔬生產(chǎn)和出口大國，然而由于發(fā)達國家的技術(shù)壁壘[38]，我國的果蔬出口量并沒有因進入WTO 而大幅

59、度的提高。所以，建立和完善果蔬中的農(nóng)藥殘留及各種限量物質(zhì)的檢測方法越來越重要。</p><p>　　目前，高效液相和氣相色譜法在果蔬赤霉素檢測上的應(yīng)用及研究越來越廣泛。由于質(zhì)譜儀的檢測較靈敏、檢測限低，開始對聯(lián)用技術(shù)有了初步的探索。隨著科技的不斷發(fā)展進步，聯(lián)用檢測技術(shù)將會成為未來研究的重點。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><

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66、幼苗中植物生長調(diào)節(jié)劑[J].分析試驗室,1997,16(5):66-69.</p><p>　　[15]朱智甲,郝振芳,張曉惠,等.高效液相色譜紫外檢測法測定小麥幼苗中的內(nèi)源激素[J].光譜實驗室,1999,16(3):281-283.</p><p>　　[16]湛社霞,孫世宏,臧李納,等.高效液相色譜法測定水果中的赤霉素、苯甲酸、糖精鈉和胭脂紅[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2008,18(

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72、375.</p><p>　　[25]張玉宗,陳振玲,呂杏者,等.高效液相色譜法測定谷子幼苗中的GA1和GA3[J].色譜,1999,17(5):469-472.</p><p>　　[26]喬坤云,張 敏.高壓液相色譜測定新疆庫爾勒香梨中赤霉素(GA3)方法研究[J].特產(chǎn)研究,2002(4):25-26.</p><p>　　[27]朱曙東,趙 琛,趙文君,等.

73、反相高效液相色譜分析赤霉素GA3含量[J].藥學學報,1993,28(10):788-791.</p><p>　　[28]黃紅林,劉 實,張?zhí)抑?固相萃取-高效液相色譜測定番茄中的赤霉素GA3殘留[J].分析科學學報,2005,25(1):75-77.</p><p>　　[29]付 磊,陶燕飛.氣相色譜法測定草莓中的赤霉素[J].武漢科技大學學報(自然科學版),2002,25(4):3

74、59-360.</p><p>　　[30]許慶琴,范哲鋒,杜黎明.大口徑毛細管氣相色譜法快速測定植物組織中的赤霉素[J].分析科學學報,2000,16(6):524.</p><p>　　[31]黃紅林,張?zhí)抑?劉 實,等.SPE—GC—MS選擇離子法直接測定果品中赤霉素殘留量[J].理化檢驗-化學分冊,2006,3:194-196.</p><p>　　[32

75、]馬煥普.用GC—MS檢測蘋果種子層積過程中內(nèi)源MeJA,GA3,GA4和GA7的變化[J].植物生理學報,1996,22(1):81-88.</p><p>　　[33]吳 萍,劉 玲.芥藍未熟種子赤霉素的GC/MS定性分析[J].質(zhì)譜學報,1997,18(2):67-76.</p><p>　　[34]梁 沛,張?zhí)抑?黃紅林.固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定水果中的赤霉素GA3殘留[J

76、].第四屆海峽兩岸分析化學學術(shù)會議論文集,2006(11):68-69.</p><p>　　[35]劉艷琴,王浩,楊紅梅,等.高效液相色譜一串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用測定水果和蔬菜中赤霉素殘留量[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2009(16):330-331.</p><p>　　[36]王 駿,張 卉,胡 梅,等.液相色譜一質(zhì)譜測定獼猴桃中赤霉素和脫落酸的含量[J].食品工業(yè),2008(4):74-76

77、.</p><p>　　[37]Shengjie Hou, Jiang Zhu, Mingyu Dinga,et al. Simultaneous determination of gibberellic acid, indole-3-acetic acid and abscisic acid in wheat extracts by solid-phase extraction and liquid chrom

78、atography–electrospray tandem mass spectrometry[J]. Talanta,2008(76):798–802.</p><p>　　[38]何解定.中國突破農(nóng)產(chǎn)品出口技術(shù)壁壘的對策研究[J].社會縱橫,2009,24(14):28-29.</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p&g

79、t;<b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　橘子及其加工制品中的赤霉素檢測</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1引言2</b></p><p>　　1.1 橘子及其加工制品的進出口現(xiàn)狀2</p>&l

80、t;p>　　1.2 赤霉素的作用2</p><p>　　1.3 赤霉素的檢測現(xiàn)狀3</p><p>　　1.3.1 高效液相色譜法3</p><p>　　1.3.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法3</p><p>　　1.3.3 氣相色譜法 和GC-MS法3</p><p>　　1.4 研究的目的與意

81、義4</p><p>　　2 實驗材料與方法4</p><p>　　2.1 儀器與設(shè)備5</p><p>　　2.2 試劑和材料5</p><p>　　2.3 實驗步驟5</p><p>　　2.3.1 提取5</p><p>　　2.3.2 凈化6</p>

82、<p>　　2.3.3 檢測6</p><p>　　2.4 色譜條件6</p><p>　　2.4.1 液相色譜參考條件6</p><p>　　2.4.2 質(zhì)譜參考條件6</p><p>　　2.5 結(jié)果計算7</p><p>　　2.5.1 計算赤霉素的回收率7</p>

83、<p>　　2.5.2 計算橘子樣品中赤霉素的殘留量7</p><p><b>　　3 結(jié)果與討論8</b></p><p>　　3.1 前處理方法的優(yōu)化8</p><p>　　3.1.1 提取液的確定8</p><p>　　3.1.2 提取過程的條件優(yōu)化8</p><p&

84、gt;　　3.1.3 固相萃取柱的選擇8</p><p>　　3.2 色譜條件的優(yōu)化10</p><p>　　3.2.1 流動相的選擇10</p><p>　　3.2.2 進樣量的大小的確立11</p><p>　　3.3 檢測儀器的改進11</p><p>　　3.3.1 高效液相色譜法11&

85、lt;/p><p>　　3.3.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法12</p><p>　　3.3.3 超級液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法12</p><p>　　3.4 標準曲線的繪制及最低檢測限13</p><p>　　3.5 回收率及變異系數(shù)的測定14</p><p>　　3.6 橘子樣品的檢測15</p>

86、<p><b>　　4 結(jié)論15</b></p><p>　　致 謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻16</b></p><p>　　摘 要： 本論文提出了在橘子及其加工制品中檢測赤霉素殘留的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法。橘子樣品采用90%的丙酮溶液提取，經(jīng)MAX柱凈化，最后用甲醇定容

87、檢測。色譜柱為Atlantis C18柱(3µm, 2.1mm×150mm )；流動相為甲醇-水及0.01m M的磷酸緩沖液；赤霉素質(zhì)譜測定的定量離子對為345.0→239.0，主要定性離子對分別為345.0→143.1、345.0→221.1以及345.0→83.1。赤霉素濃度在0.01µg/mL～0.1µg/mL范圍內(nèi)，藥物峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)為0.9991。該方法具有較好

88、的回收率及穩(wěn)定性，赤霉素的最低檢測限為0.01µg/mL定量下限可達2µg/kg，低于美國、日本等國家和地區(qū)對赤霉素在水果蔬菜中的最高殘留0.2ppm的規(guī)定。</p><p>　　關(guān)鍵詞：橘子及其加工制品；赤霉素；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；檢測</p><p>　　Abstract：A method of LC-M S-MS for the detection of gibbe

89、rellin residue in mandarin orange and its processing produces has been developed. Samples were extracted with 90% acetonewater solution before being purified by MAX solid phase. At last, using methanol to make the volume

90、 constant. The solution was separated on a C18 reversed-phase column(3µm, 2.1mm×150mm ), using methanol-water containing 0.01 mM phosphate as the mobile phase. Qualitative ion of SRM was 345.0→239.0 for GA3, an

91、d its main qu</p><p>　　Key words：Mandarin orange and its processing produces; Gibberellin; LC-MS-MS; Detection</p><p><b>　　1引言</b></p><p>　　1.1 橘子及其加工制品的進出口現(xiàn)狀</p&

92、gt;<p>　　橘子含水量高、營養(yǎng)豐富，含大量維生素C、枸櫞酸及葡萄糖等十余種營養(yǎng)物質(zhì)。食用得當，能補益肌體，特別對患有慢性肝炎和高血壓患者，多吃蜜橘可以提高肝臟解毒作用，加速膽固醇轉(zhuǎn)化，防止動脈硬化。</p><p>　　橘子及橘子罐頭是中國的大宗出口產(chǎn)品，已成為部分地區(qū)主要的經(jīng)濟來源。十年前，憑借著原料價格和人力資源的相對優(yōu)勢，中國橘子罐頭就迅速占領(lǐng)了日本市場和歐美市場，成了進口商的搶手貨，成

93、交額約占世界貿(mào)易量的80％以上。2002年中國橘子罐頭的出口約占世界貿(mào)易量的三分之一。中國罐頭行業(yè)的出口強勢引起了西班牙的不滿，以往該國產(chǎn)品也主要銷往歐美市場，是與中國競爭市場份額的惟一對手。西班牙不甘心自己的失利，向歐盟委員會提出申請，希望對原產(chǎn)于中國的橘子罐頭采取保障措施[1]，歐盟將研究上調(diào)該產(chǎn)品的關(guān)稅或采取限額進口的做法。</p><p>　　浙江省是橘子罐頭生產(chǎn)大省，占全國產(chǎn)量的80%，全世界產(chǎn)量的70

94、%，對歐盟的出口量也在全國各省份中居于首位。據(jù)寧波檢驗檢疫局統(tǒng)計，2007年，寧波地區(qū)共出口桔子罐頭92389.68噸，金額7306.20萬美元，比上年分別增長0.72%和3.72%，約為全國出口桔子罐頭總量的三分之一，成為全國出口桔子罐頭最多的城市。據(jù)象山檢驗檢疫局統(tǒng)計，2010年前10個月，象山地區(qū)共出口橘子罐頭1026批、29433.74噸、貨值3281.5萬美元，同比分別增長16.2%、19.7%和14%。</p>

95、<p>　　1.2 赤霉素的作用</p><p>　　赤霉素是一種廣譜性植物生長調(diào)節(jié)劑，幾乎在植物生長、發(fā)育的各個階段都起著調(diào)節(jié)作用。赤霉素在植物體內(nèi)的形成部位一般是嫩葉、芽、幼根以及未成熟的種子等幼嫩組織。1926年日本病理學家黑澤在水稻惡苗病的研究中發(fā)現(xiàn)水稻植株發(fā)生徒長是由赤霉菌的分泌物所引起的。1935年日本藪田從水稻赤霉菌中分離出一種活性制品，并得到結(jié)晶，定名為赤霉素（GA）。第一種被分離鑒

96、定的赤霉素稱為赤霉酸（GA3），化學式見下圖1。目前，已從高等植物和微生物中分離出70余種赤霉素。</p><p>　　圖1 赤霉素化學結(jié)構(gòu)式</p><p>　　赤霉素中生理活性最強、研究最多的是GA3。它能顯著地促進植物莖、葉生長，特別是對遺傳型和生理型的矮生植物有明顯的促進作用；能代替某些種子萌發(fā)所需要的光照和低溫條件，從而促進發(fā)芽；可使長日照植物在短日照條件下開花，縮短生活周期；能

97、誘導(dǎo)開花，增加瓜類的雄花數(shù)，誘導(dǎo)單性結(jié)實，提高坐果率，促進果實生長，延緩果實衰老。除此之外，GA3還可用于防止果皮腐爛；在棉花盛花期噴灑能減少蕾鈴脫落；馬鈴薯浸種可打破休眠；大麥浸種可提高麥芽糖產(chǎn)量等等。</p><p>　　1.3 赤霉素的檢測現(xiàn)狀</p><p>　　1.3.1 高效液相色譜法</p><p>　　高效液相色譜是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法。在

98、70年代末，高效液相色譜開始逐步用于檢測除乙烯以外的植物激素。國外研究者那時也開始研究用高效液相色譜儀來分離檢測赤霉素GA3組份的含量了。Reeve等人在把赤霉素各組份的羧基酯化后，再用高效液相色儀來分離其酯化衍生物。Lin J.T.等則是用反相高效液相色譜技術(shù)來直接分離赤霉素各組份。實驗證明[2]高效液相色譜對赤霉素的定性、定量測量是準確可靠的。</p><p>　　目前，高效液相色譜除了可以有效地分離植物內(nèi)的

99、各個赤霉素同系物，同時還可以用于赤霉素的定量檢測。朱曙東等[3]在研究赤霉素的定量檢測方法時，運用RP-HPLC成功地將GA3與其它組分分離，建立了精確測定GA3含量的新方法。其優(yōu)越性全面超出各傳統(tǒng)分析方法，可望成為赤霉素質(zhì)量分析的標準方法。黃紅林等[4]研究建立了固相萃取-高效液相色譜(SPE-HPLC)法來分析測定番茄中赤霉素GA3殘留量。</p><p>　　1.3.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法</p&g

100、t;<p>　　隨著聯(lián)用技術(shù)的日趨完善，HPLC-MS逐漸成為最熱門的分析手段之一。HPLC -MS作為已經(jīng)比較成熟的技術(shù)，目前己在生化分析、天然產(chǎn)物分析、藥物和保健食品分析以及環(huán)境污染物分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。利用HPLC-MS分析混合樣品，和其他方法相比具有高效快速，靈敏度高，只需品進行簡單預(yù)處理或衍生化，尤其適用于含量少、不易分離得到或在分離過程中易的組分。</p><p>　　梁沛等

101、[5]采用固相萃取技術(shù)對樣品進行處理，以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜為檢測手段，建立了測定水果中赤霉素GA3殘留的新方法，可以為確定赤霉素殘留標準提供實驗依據(jù)。劉艷琴等[6]也采用高效液相色譜一串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)來測定水果和蔬菜中赤霉素，并建立了相關(guān)的檢測方法。該法具有樣品處理簡單、測定周期短等優(yōu)點，適用于大量樣品的快速篩選、測定。王駿等[7]建立用HPLC-MS測定獼猴桃中赤霉素和脫落酸殘留量的方法。盛杰厚等[8]則是采用固相萃取和液質(zhì)聯(lián)用儀，同時

102、檢測小麥種的赤霉素、吲哚乙酸和脫落酸，并獲得了較高的回收率。</p><p>　　1.3.3 氣相色譜法 和GC-MS法</p><p>　　近年來，質(zhì)譜儀的出現(xiàn)為檢測果蔬中的赤霉素創(chuàng)造了條件。采用GC和GC-MS等儀器進行分析檢測，靈敏度高，重復(fù)性好，尤其適用于痕量植物樣品的測定。</p><p>　　氣相色譜常被用于檢測植物果蔬中的各種農(nóng)藥殘留，特別適用于揮發(fā)

103、性的物質(zhì)的檢測。付磊[9]研究草莓中外源植物激素GA3時采用氣相色譜進行檢測分析，建立了一種采用530µm大口徑毛細管色譜柱、不經(jīng)衍生化處理而直接測定植物生長素GA3的氣相色譜方法。許慶琴等[10]對不同固定相的大口徑毛細管柱進行了考察，發(fā)現(xiàn)赤霉素在非極性固定相毛細管柱中不僅靈敏度高、出峰速度快，而且重現(xiàn)性好。采用太口徑毛細管色譜柱，無需衍生化處理，直接進樣測定樣品中赤霉素含量結(jié)果令人滿意。</p><p&

104、gt;　　為了更加準確地對赤霉素進行定性分析，很多研究中往往采用靈敏度高、檢測限較低的質(zhì)譜儀，特別能適用于在植物中含量本身就比較微量的赤霉素。黃紅林等[11]采用固相萃取代替?zhèn)鹘y(tǒng)的液液萃取，研究了樣品在C18萃取柱上的保留行為，純化效果顯著。采用HP-1的色譜柱，無需柱前衍生化，直接進樣GC-MS測定，選擇離子監(jiān)測(SIM)克服了樣品基體干擾，靈敏度較全譜掃描高。并建立了固相萃氣相色譜質(zhì)譜選擇離子(SPE-GC-MS)直接分析果品中赤霉

105、素(GA3)殘留量的方法。馬煥普[12]已將GC-MS方法用于檢測蘋果種子層積過程中GA7的變化，并獲得了相關(guān)的檢測數(shù)據(jù)。吳萍等[13]先借助生物試法對芥藍中的赤霉素進行必要的分離純化，并采用質(zhì)譜法進行檢測，從而實現(xiàn)了對芥藍種子中GAs的定性、定量分析。 </p><p>　　1.4 研究的目的與意義</p><p>　　我國加入世貿(mào)組織后，在外貿(mào)進出口方面，從我國出口的食品由于雜質(zhì)、

106、農(nóng)藥殘留[14]及食物添加劑含量高、標簽不清等問題而屢有退貨，不僅損害我國農(nóng)產(chǎn)品出口，也給國家形象和信譽帶來了負面影響。作為技術(shù)壁壘之一，歐盟成員國已開始高度關(guān)注中國橘子罐頭的農(nóng)藥殘留問題，鑒于目前沒有確鑿證據(jù)，不能采取保護措施，為此把目光轉(zhuǎn)向了反傾銷條款，以對付中國橘子罐頭的外銷。</p><p>　　赤霉素作用廣泛[15,16]，但屬于低毒植物生長調(diào)節(jié)劑，當大量使用時會產(chǎn)生一定毒性。根據(jù)日本肯定列表最終數(shù)據(jù)查

107、詢  (2006年5月29日起實施) 暫定 菠菜、菠蘿、草菇、草莓、橙(包括臍橙)、蔥(包括韭蔥) 大白菜、大蒜、豆瓣菜、鱷梨、番木瓜、番茄、番石榴、繁殖洋蔥等使用的最高限量MRL為0.2 ppm。美國(USA)允許蘋果中的農(nóng)藥殘留限量要求（1999年3月15日）聯(lián)邦法律條款（40 CFR 120）赤霉素殘留限量（Tolerance, ppm）為0.5。中國臺灣2007年2月1日公布了有關(guān)食品內(nèi)殺蟲劑殘留限