食品營養(yǎng)與檢測職業(yè)學(xué)院畢業(yè)論文-飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定

1、<p>　　畢 業(yè) 論 文（設(shè)計）</p><p>　　題 目 飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定 </p><p>　　指導(dǎo)老師 張波 </p><p>　　專業(yè)班級 食品營養(yǎng)與檢測122 </p><

2、;p>　　姓 名 薛雨霖 </p><p>　　學(xué) 號 20127100213 </p><p>　　2015年 5月 28日</p><p>　　摘要：蛋白酶在一定的溫度和pH條件下，水解酪素底物產(chǎn)生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸

3、、色氨酸），在堿性條件下，將福林試劑（Folin）還原，生成鉬藍與鎢藍，其顏色的深淺與酚基氨基酸含量成正比。通過在660nm測定其吸光度，計算出蛋白酶活力。本實驗確定了樣品的提取液為蒸餾水、底物酪蛋白用量為1mL、樣品的稀釋倍數(shù)（酸性蛋白酶為1500-2500，中性蛋白酶為500-2000），并對樣品中酸性和中性蛋白酶活力的穩(wěn)定性進行測定，測得的穩(wěn)定性較高。本方法測得的兩種樣品的標準偏差均小于10%，因此該方法具有良好的精密度。<

4、/p><p>　　關(guān)鍵詞：飼料添加劑；酸性和中性蛋白酶；酶活力</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　引言1</b></p><p><b>　　1 材料和儀器1</b></p><p><b>　　1.1 原

5、料1</b></p><p>　　1.2 儀器設(shè)備1</p><p>　　1.3 主要試劑1</p><p><b>　　2 實驗方法2</b></p><p>　　2.1 主要試劑的配制2</p><p>　　2.1.1 1mol/L及0.1mol/L的鹽酸溶液的配制2

6、</p><p>　　2.1.2 0.4mol/L的碳酸鈉溶液的配制2</p><p>　　2.1.3 福林試劑的配制2</p><p>　　2.1.4 pH3.5乳酸緩沖液的配制2</p><p>　　2.1.5 pH7.0的磷酸緩沖液的配制2</p><p>　　2.1.6 1.0%酪蛋白溶液的配制

7、2</p><p>　　2.1.7 0.4mol/L的三氯乙酸溶液的配制3</p><p>　　2.1.8 L-酪氨酸標準溶液的配制3</p><p>　　2.2 樣品酶液的制備3</p><p>　　2.3 酸性和中性蛋白酶活力的測定方法3</p><p><b>　　2.4 計算4</

8、b></p><p><b>　　3 結(jié)果與分析4</b></p><p>　　3.1 標準曲線繪制4</p><p>　　3.2 實驗條件對飼料蛋白酶活力的影響5</p><p>　　3.2.1樣品提取液對酸性蛋白酶活力的影響5</p><p>　　3.2.2底物酪蛋白用量對酸性和

9、中性蛋白酶活力的影響6</p><p>　　3.2.3不同稀釋倍數(shù)的樣品酶液對酸性和中性蛋白酶活力的影響6</p><p>　　3.2.4對酸性和中性蛋白酶活力穩(wěn)定性的測定7</p><p><b>　　結(jié)論7</b></p><p><b>　　參考文獻8</b></p>

10、<p><b>　　引言</b></p><p>　　蛋白酶是飼料工業(yè)中比較常見的一種飼用酶，蛋白酶是可以使蛋白質(zhì)水解成α-氨基酸的酶，蛋白酶分為酸性酶、堿性酶、中性酶，酸性酶適宜pH值為2-5，產(chǎn)生該酶的微生物主要有黑曲霉、根霉、米曲霉；中性蛋白酶的最適宜pH值為7左右，活力值最高時約在4-50℃，主要由霉菌和細菌產(chǎn)生，其測定分析方法主要有福林顯色法、紫外光譜法。因其紫外分光光度

11、測定法的檢出限和定量限都顯著低于福林酚法測定法，本文使用福林顯色法測定兩種酶的活性，其原理是蛋白酶在一定的溫度和pH條件下，水解酪素底物產(chǎn)生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在堿性條件下，將福林試劑（Folin）還原，生成鉬藍與鎢藍，其顏色的深淺與酚基氨基酸含量成正比。通過在660nm測定其吸光度，計算出蛋白酶活力。本實驗采用福林顯色法對飼料蛋白酶活力進行測定，摸索福林酚法測定蛋白酶的條件。并對反應(yīng)條件進行優(yōu)化，以提高測定的準確性。

12、</p><p><b>　　1 材料和儀器</b></p><p><b>　　1.1 原料 </b></p><p>　　含酸性蛋白酶的飼料,含中性蛋白酶的飼料。</p><p><b>　　1.2 儀器設(shè)備</b></p><p>　　Lambd

13、a-20型紫外可見分光光度計(美國Pekin-Elmer公司)、Sartorious BS 223S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、HHS-4型電熱恒溫水浴鍋、精密pH計、秒表等。</p><p><b>　　1.3 主要試劑 </b></p><p>　　1mol/L及0.1mol/L的鹽酸溶液、0.4mol/L的碳酸鈉溶液、福林試劑、pH3.5的乳酸緩

14、沖液、pH7.0的磷酸緩沖液、1.0％的酪素溶液（干酪素由杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)）、0.4mol/L的三氯乙酸溶液 、100μg/mL L-酪氨酸標準溶液。</p><p><b>　　2 實驗方法 </b></p><p>　　2.1 主要試劑的配制 </p><p>　　2.1.1 1mol/L及0.1mol/L的鹽酸溶液的配制<

15、;/p><p>　　取濃鹽酸85mL,加水稀釋并定容至1000mL，即為1mol/L鹽酸溶液；取100mL1mol/L鹽酸溶液，定容至1000mL，即為0.1mol/L鹽酸溶液。</p><p>　　2.1.2 0.4mol/L的碳酸鈉溶液的配制</p><p>　　稱取無水碳酸鈉42.4g，用水溶解并定容至1000mL。</p><p>　　

16、2.1.3 福林試劑的配制</p><p>　　于1000mL磨口回流裝置中加入鎢酸鈉（NaWO4.2H2O）100g、鉬酸鈉(Na2MoO4.2H2O)25g、水700mL、85%磷酸50mL、濃鹽酸100mL。小火沸騰回流10h，取下回流冷卻器，在通風(fēng)廚中加入硫酸鋰（Li2SO4）50g，加水50mL和數(shù)滴濃溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷卻后仍有綠色需再加溴水，再煮沸除去過量的溴），冷卻

17、后加水定容至1000mL?；靹蜻^濾。試劑應(yīng)呈金黃色，貯存于棕色瓶內(nèi)。使用時，以1份福林試劑與2份水混勻，制成稀福林試劑。</p><p>　　2.1.4 pH3.5乳酸緩沖液的配制</p><p>　　甲液：稱取80%-90%乳酸10.6g,加水稀釋并定容至1000mL。</p><p>　　乙液：稱取70%乳酸鈉16g，加水稀釋并定容至1000mL。</p

18、><p>　　使用溶液：取甲液2份，加乙液1份，再準確稀釋1倍。用pH計調(diào)整pH至3.5,備用。</p><p>　　2.1.5 pH7.0的磷酸緩沖液的配制</p><p>　　甲液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O）71.64g，用水溶解，并定容至100mL。</p><p>　　乙液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4.2H2O）3

19、1.21g，用水溶解，并定容至1000mL。</p><p>　　使用溶液：取甲液610mL，加乙液390mL混勻，用pH計調(diào)整pH至（7.0±0.05），備用。</p><p>　　2.1.6 1.0%酪蛋白溶液的配制</p><p>　　精確稱取酪蛋白1.0000g，先用少量濃乳酸濕潤后，再加入乳酸緩沖液使用溶液約80mL（若測定中性蛋白酶，則先用少

20、量0.5mol/L氫氧化鈉溶液濕潤后，再加磷酸緩沖液使用溶液約80mL）。在沸水浴中邊加熱邊攪拌直至完全溶解。冷卻后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用相應(yīng)緩沖溶液定容至刻度。此容液在4℃冰箱貯存，有效期為3天。</p><p>　　2.1.7 0.4mol/L的三氯乙酸溶液的配制</p><p>　　稱取三氯乙酸65.4g,用水溶解，并定容至1000mL。</p><p>

21、;　　2.1.8 L-酪氨酸標準溶液的配制</p><p>　　精確稱取預(yù)先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸標準物質(zhì)0.1000g，用20mL mol/L鹽酸溶解后，再用蒸餾水定容至100mL，即為1mg/mL酪氨酸標準儲備溶液。吸取1mg/mL酪氨酸標準儲備溶液10.0mL用0.1mol/L鹽酸定容至100mL，即得到100ug/mL L－酪氨酸標準溶液。</p><p>　　2.2

22、樣品酶液的制備</p><p>　　含酸性蛋白酶的添加劑飼料：稱取2g樣品，精致0.01g，于100mL容量瓶中，加入90mL蒸餾水或乳酸緩沖液，搖勻后置40℃水浴浸提30min，取出冷卻后定容至100mL，過濾。濾液根據(jù)酶活性大小，用乳酸緩沖液使用溶液稀釋至適宜濃度。</p><p>　　含中性蛋白酶的添加劑飼料：稱取2g樣品，精致0.01g，于100mL容量瓶中，加入90mL蒸餾水或磷

23、酸緩沖液，搖勻后置40℃水浴浸提30min，取出冷卻后定容至100mL，過濾。濾液根據(jù)酶活性大小，用乳酸緩沖液使用溶液稀釋至適宜濃度。</p><p>　　2.3 酸性和中性蛋白酶活力的測定方法</p><p>　　取三支15×150mm試管（一支空白管，二支樣品管），分別向三支試管中準確加入稀釋好的待測酶液1.0mL，將試管放入（40±0.2）℃水浴中預(yù)熱5min，向

24、二支樣品管中再加入一定量的經(jīng)同樣預(yù)熱的1%酪素溶液，準確計時，反應(yīng)10min，取出。迅速、準確向三支試管中加入0.4mol/L三氯乙酸溶液2mL，于空白管中加入與樣品管一樣量的1%酪素溶液，搖勻。將三支試管繼續(xù)置（40±0.2）℃水浴中放置10min，取出迅速冷卻至室溫。將三支試管中的反應(yīng)液離心或過濾。另取三支18×180mm的試管（一支空白管，二支樣品管）分別吸取上述相應(yīng)的濾出液1.0mL，0.4mol/L碳酸鈉溶

25、液5.0mL，稀福林試劑1.0mL,搖勻，置（40±0.2）℃水浴中放置20min，取出，迅速冷卻至室溫。以空白管（對照）調(diào)儀器零點，在風(fēng)光光度計波長660nm下，用10mm比色杯，分別測二支樣品管中樣液的吸光度，取平均值。</p><p><b>　　2.4 計算</b></p><p>　　按照下式計算樣品中酸性和中性蛋白酶的活力：</p>

26、<p>　　X1 =……………………………..公式（2.1）</p><p>　　X1—蛋白酶活力，U/g（U/mL）</p><p>　　A—樣品與空白的吸光度差</p><p><b>　　K—比色常數(shù)</b></p><p>　　V—樣品提取時加入水的量（mL）</p><p>

27、　　Z—酶反應(yīng)體系總體積（mL）</p><p>　　N—樣品二次稀釋時的稀釋倍數(shù)</p><p>　　1—參與反應(yīng)的酶量(mL)</p><p>　　W—樣品重量（g或mL）</p><p><b>　　10—反應(yīng)時間</b></p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b&g

28、t;</p><p>　　3.1 標準曲線繪制</p><p>　　分別吸取100μg/mL L－酪氨酸標準溶液0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL于10mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。分別吸取L-酪氨酸標準使用溶液1.0mL，加碳酸鈉溶液5.0mL和稀福林試劑1.0mL，于標準管中，混勻，見表3.1。將標準管同時置于40℃水浴，反應(yīng)20m

29、in，取出，迅速冷卻至室溫，以空白管調(diào)儀器零點，在分光光度計波長660nm處測吸光度。以吸光度為橫坐標，以酪氨酸量為縱坐標，繪制標準曲線，獲得線性回歸方程,見圖3.1。當(dāng)吸光度為1時得酪氨酸量（μg）即為比色常數(shù)K值，K＝97.5539。新配制的福林試劑制作新的標準曲線。</p><p>　　表3.1 標準曲線數(shù)據(jù)</p><p>　　圖3.1 標準曲線圖</p><p

30、>　　3.2 實驗條件對飼料蛋白酶活力的影響</p><p>　　3.2.1樣品提取液對酸性蛋白酶活力的影響</p><p>　　稱取2g含酸性蛋白酶的飼料2份（每份做三個平行樣），一份加蒸餾水提取，另一份加pH3.5的乳酸緩沖液提取，兩種不同的提取液對酸性蛋白酶活力的影響見表3.2。</p><p>　　表3.2 兩種不同提取液對酸性蛋白酶活力的影響<

31、/p><p>　　項 目 蒸餾水 pH3.5的乳酸緩沖液</p><p>　　7418 7486</p><p>　　7223 7626</p><p>　　7325 7511

32、</p><p>　　酸性蛋白酶活力（U/mL） 7322 7541</p><p>　　注：此結(jié)果為三次測得的平均值。</p><p>　　從表3.2可知，用蒸餾水與乳酸緩沖液提取樣品測得的酸性蛋白酶活力無明顯差別，故下面實驗均采用蒸餾水作樣品的提取液。</p><p>　　3.2.2

33、底物酪蛋白用量對酸性和中性蛋白酶活力的影響</p><p>　　將1mL的樣品稀釋液與1mL、2mL底物酪蛋白分別反應(yīng)，實驗結(jié)果見表3.3。</p><p>　　表3.3 底物酪蛋白用量對酸性和中性蛋白酶活力的影響</p><p>　　由表3.3可知，酪蛋白用量從1mL增加到2mL，酸性蛋白酶活力和中性蛋白酶活力都沒有明顯的變化，說明底物用量為1mL時酶與底物酪蛋白

34、的結(jié)合已經(jīng)飽和，因此底物酪蛋白用量都仍然采用1mL。</p><p>　　3.2.3不同稀釋倍數(shù)的樣品酶液對酸性和中性蛋白酶活力的影響</p><p>　　不同稀釋倍數(shù)的樣品酶液對酸性和中性蛋白酶活力的影響，見表3.4和表3.5.</p><p>　　表3.4 不同稀釋倍數(shù)對酸性蛋白酶活力的影響</p><p>　　由表3.4可知吸光度差在0

35、.15-0.3之間酸性蛋白酶活力較穩(wěn)定，本樣品可選擇稀釋倍數(shù)在1500-2500范圍之內(nèi)。本實驗選擇稀釋倍數(shù)為2000，對酸性蛋白酶活力進行測定。</p><p>　　表3.5 不同稀釋倍數(shù)對中性蛋白酶活力的影響</p><p>　　由表3.5可知樣品吸光度差在0.1-0.4之間中性蛋白酶活力較穩(wěn)定，本樣品可選擇稀釋倍數(shù)在500-2000范圍之內(nèi)。本實驗選擇稀釋倍數(shù)為1000，對中性蛋白酶

36、活力進行測定。</p><p>　　3.2.4對酸性和中性蛋白酶活力穩(wěn)定性的測定</p><p>　　稱取樣品酸性蛋白酶飼料2g稀釋2000倍，中性蛋白酶飼料1g稀釋1000倍，分別吸取稀釋液與1mL1%的酪蛋白反應(yīng)，分別做6個平行樣，對酸性和中性蛋白酶活力進行穩(wěn)定性測定,見表3.6。由表3.6可知，酸性蛋白酶活力和中性蛋白酶活力都具有較高的穩(wěn)定性。</p><p>

37、;　　表3.6 酸性和中性蛋白酶活力穩(wěn)定性</p><p><b>　　結(jié)論</b></p><p>　　本文采用福林顯色法對飼料添加劑酸性和中性蛋白酶活力進行測定，實驗中進一步確定了樣品的提取液為蒸餾水、底物酪蛋白用量為1mL和樣品的稀釋倍數(shù)（酸性蛋白酶為1500-2500，中性蛋白酶為500-2000），并對樣品中酸性和中性蛋白酶活力的穩(wěn)定性進行測定。本方法測得的

38、兩種樣品的標準偏差均小于10%，因此該方法具有良好的精密度。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]趙林果．復(fù)合酶制劑降解植物性飼料的研究[J]．飼料研究，2001，1(1)：2．</p><p>　　[2]張學(xué)英．蛋白酶及其活力的測定[J]．2008，28(6)：1-3．</p><p&g

39、t;　　[3]張寒俊，劉大川，楊國燕．紫外光譜法定量測定不同蛋白酶活力的研究[J]．糧食與飼料工業(yè)，2004，21(9)：3-6．</p><p>　　[4]雷紅松，張學(xué)英．標準曲線法在分析檢測中的應(yīng)用及討論[J]．釀酒科技，2007，18(9)：64-65．</p><p>　　[5]郝欣，肖冬光，郭學(xué)武，王妍．純生啤酒中酸性蛋白酶測定方法的優(yōu)化[J]．釀酒科技，2007，26(11)：