酶解對玉米醇溶蛋白水溶性的影響學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文

1、<p><b>　　摘 要</b></p><p>　　玉米醇溶蛋白是玉米黃粉其中利用價值較高的副產(chǎn)物，其附加價值有很高的提升空間。本課題是以玉米醇溶蛋白為原料，通過胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白，并測定水解后玉米醇溶蛋白的最佳水解條件，溶解條件，以及在兩者最佳條件下，醇溶蛋白對Fe2+ Cu2+的螯合能力的影響， 以使其有更大的應(yīng)用空間。通過單因素試驗研究，得出胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋

2、白的最佳工藝條件為：反應(yīng)時間2h，反應(yīng)溫度27℃，酶添加量640U/g，玉米醇溶蛋白底物濃度為7%，乙醇濃度為75%，并對在最佳工藝條件下水解的脫玉米醇溶蛋白的水解度和與Fe2+Zn2+螯合能力進(jìn)行研究。</p><p>　　關(guān)鍵詞：玉米醇溶蛋白，酶解，水解度，螯合能力</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　

3、Zein is the by-product of corn gluten by high value, high added value promotion space. This topic is based on zein as raw materials, by Trypsin Hydrolysis&

4、#160;of zein, and determination ofhydrolysis of zein degree of hydrolysis and Zn2+ chelating ability, provide a theoretical basisfor further development and utilization of zein. Th

5、rough single factor experiments, the optimumconditions of Trypsin Hydrolysis of zein protein:substrate concentration of 7% alcohol solublecorn, reaction time 2h, ethanol </

6、p><p>　　Key words: Zein, Trypsin, Degree of hydrolysis</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1. 前言2</b></p><p>　　1.1 課題背景2</p>&

7、lt;p>　　1.2 研究概況2</p><p>　　1.3 本課題的目的、意義3</p><p><b>　　2材料與方法4</b></p><p>　　2.1實驗材料與設(shè)備4</p><p>　　2.1.1實驗材料與試劑4</p><p>　　2.1.2 實驗儀器設(shè)備4<

8、;/p><p>　　2.2 實驗方法5</p><p>　　2.2.1 胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白條件優(yōu)化5</p><p>　　2.2.1.1 反應(yīng)時間對水解度的影響5</p><p>　　2.2.1.2 反應(yīng)溫度對水解度的影響5</p><p>　　2.2.1.3 酶添加量對水解度的影響5</p>

9、<p>　　2.2.1.4 底物濃度對水解度的影響6</p><p>　　2.2.1.5 乙醇濃度對水解度的影響6</p><p>　　2.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析6</p><p>　　2.2.2.1 樣品處理6</p><p>　　2.2.2.2 樣品電泳6</p><p>　　

10、2.2.2.3 膠片染色和脫色7</p><p>　　2.2.2.4 結(jié)果分析7</p><p>　　2.2.3 玉米醇溶蛋白水解物與Zn2+螯合能力的測定7</p><p>　　2.2.4 玉米醇溶蛋白水解度測定方法7</p><p>　　2.2.4.1 實驗原理7</p><p>　　2.2.4.2 試劑

11、的配制8</p><p>　　2.2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制8</p><p>　　2.2.4.4 樣品中游離氨基含量和蛋白質(zhì)水解度（DH）的測定8</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析8</b></p><p>　　3.1胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白條件優(yōu)化8</p><p>　　3

12、.1.1 反應(yīng)時間對水解度的影響8</p><p>　　3.1.2 反應(yīng)溫度對水解度的影響9</p><p>　　3.1.3 酶添加量對水解度的影響10</p><p>　　3.1.4 底物濃度對水解度的影響11</p><p>　　3.1.5 乙醇濃度對水解度的影響12</p><p>　　3.2 SDS-

13、聚丙烯酰胺凝膠電泳分析13</p><p>　　3.3 玉米醇溶蛋白及水解物與Zn2+螯合能力的測定14</p><p><b>　　4. 討論15</b></p><p><b>　　5.結(jié)論15</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)16</b></p

14、><p><b>　　致 謝17</b></p><p><b>　　1. 前言</b></p><p><b>　　1.1 課題背景</b></p><p>　　介紹玉米 介紹玉米副產(chǎn)物 醇溶蛋白性質(zhì)應(yīng)用 發(fā)展前景</p><p>　　我國玉米年產(chǎn)量已

15、達(dá)1．1左右億噸，黑龍江省是我國玉米主產(chǎn)地之一。玉米80％以上成份是淀粉類物質(zhì)，它的出路決定了玉米深加工企業(yè)的發(fā)展，而玉米深加工企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益更多地來源于玉米胚芽、玉米蛋白等副產(chǎn)品綜合深加工。以低脂玉米粉生產(chǎn)淀粉糖時，產(chǎn)生大量副產(chǎn)物玉米渣。玉米渣中含有30％左右的蛋白質(zhì)，其中70％為醇溶蛋白。經(jīng)提純后醇溶蛋白質(zhì)含量高達(dá)90％以上。玉米醇溶蛋白有較強(qiáng)的疏水性，為改善它的食品功能，就必須使其具有水溶性。</p><p&g

16、t;　　于是，利用酶解來研究對玉米醇溶性蛋白的影響成為重點。然而，限制玉米醇溶蛋白蓬勃發(fā)展的最主要因素是其生產(chǎn)成本。為了擴(kuò)大玉米綜合利用的范圍，提高玉米的附加值，為醇溶蛋白的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。研究了從玉米蛋白粉中提取醇溶蛋白的工藝，并建立了玉米醇溶蛋白提取量的快速檢測方法，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用中心組合設(shè)計法，確定了玉米醇溶蛋白的最佳提取工藝條件：乙醇濃度80%，提取溫度60℃，液料比(mL/g)9.25，浸提時間2h。產(chǎn)品提取

17、率為50%，產(chǎn)品為淡黃色粉末，其中蛋白質(zhì)含量在90%以上。[1]</p><p>　　同時，玉米中的蛋白質(zhì)主要為醇溶蛋白, 它具有一定的粘合力,易加工成薄膜和纖維, 其薄膜的耐水性、耐熱性及耐酸性尤為出色, 可用于食品、制藥及其它領(lǐng)域。[6]</p><p><b>　　1.2研究概況</b></p><p>　　自20世紀(jì)70年代開始，世界上

18、興起玉米深加工業(yè)，美國是一馬當(dāng)先的國家。其玉米原料利用率已達(dá)到98％一99％。然而，我國在這方面的工作還比較落后，除了主產(chǎn)品淀粉以外，只有玉米油、粗蛋白粉等少數(shù)產(chǎn)品。由此可見，玉米的綜合利用及深加工是玉米產(chǎn)業(yè)化的根本出路。以玉米為原料進(jìn)行深加工的企業(yè)中，如生產(chǎn)淀粉、淀粉糖、有機(jī)酸、氨基酸等產(chǎn)品的工廠，都會產(chǎn)生大量的下腳料。在這些下腳料中，大約可以分離出占原料質(zhì)量5%-6%的玉米蛋白粉，這類玉米蛋白粉的蛋白質(zhì)含量在60%左右，但由于缺少賴

19、氨酸、色氨酸等人體必需氨基酸，其生物學(xué)價值低，目前均作為低價值飼料蛋白出售，國際上每噸僅200多美元，國內(nèi)每噸約2500 元，許多工廠甚至未作任何利用而自然排放。目前，我國每年隨廢液排放的玉米蛋白高達(dá)8萬多噸。</p><p>　　玉米醇溶蛋白是玉米蛋白粉中的主要蛋白質(zhì)，由于它不溶于水且缺乏賴氨酸、色氨酸等必需氨基酸，還存在色澤和氣味等問題，因而較少作為食品原料應(yīng)用。但玉米醇溶蛋白具有很好的成膜性、凝膠化性及較強(qiáng)

20、的抗氧化性等，隨著高度脫色、脫臭技術(shù)的發(fā)展，大大拓寬了其應(yīng)用范圍，使之成為一種用途廣泛的工業(yè)原料。［2］</p><p>　　1.3本課題的目的、意義</p><p>　　玉米淀粉生產(chǎn)工藝主要是濕法工藝，用濕法生產(chǎn)玉米淀粉的過程中會產(chǎn)生許多的玉米黃粉，玉米黃粉中含有60%以上的蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)為玉米醇溶蛋白，若不加以利用，會造成很大的浪費，但玉米醇溶蛋白不溶于水，并存在色澤和氣味問題,

21、其作為食品原料的應(yīng)用較少，如果能通過改性使之改變某些功能性質(zhì)，必會使其在食品等其他方面有所深入。</p><p>　　本課題研究了其主要蛋白，玉米醇溶蛋白的最佳水解條件，溶解條件，以及在兩者最佳條件下，醇溶蛋白對Fe2+ Cu2+的螯合能力， 以使其有更大的應(yīng)用空間。</p><p><b>　　2材料與方法</b></p><p>　　2.1

22、實驗材料與設(shè)備</p><p>　　2.1.1實驗材料與試劑</p><p>　　2.1.2實驗儀器設(shè)備</p><p><b>　　2.2 實驗方法</b></p><p>　　2.2.1提取玉米醇溶蛋白的工藝流程[3,4]</p><p>　　（1）最適條件：乙醇濃度80%；提取溫度57.9℃

23、；液料比（ml/g)9.25；浸提時間2h。</p><p>　?。?）工藝流程:玉米黃粉→粉碎過篩（70目篩）→浸泡提?。w積分?jǐn)?shù)80%乙醇，用氫氧化鈉1mol/L調(diào)至pH為8左右）→離心分離（3000r/min，15min）→提取液→冷水（10℃）→稀釋乙醇濃度至40%→調(diào)節(jié)PH(用鹽酸1mol/L調(diào)至pH為6.2左右)→靜置沉淀（30min）→水洗至中性→冷凍干燥→磨碎→成品</p><

24、p>　　2.2.胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白</p><p>　　本實驗通過研究乙醇濃度、底物濃度、反應(yīng)溫度、pH來得出玉米醇溶蛋白的最佳水解條件，溶解條件。</p><p>　　2.2.2.1乙醇濃度對胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的影響 </p><p>　　稱取一定量的玉米醇溶蛋白，并分別溶于乙醇濃度70%、75%、80%、85%、90%五個濃度梯度的乙醇溶液，將

25、反應(yīng)體系的鹽酸濃度調(diào)制pH為9，反應(yīng)溫度固定為45℃，反應(yīng)時間為1h，底物濃度5%,酶濃度5u/ml。反應(yīng)過程中，用水浴搖床進(jìn)行震蕩，使玉米醇溶蛋白與氫氧化鈉充分反應(yīng)。按照2.2.4.2測定水解程度。 按照2.2.5.3測定溶解度.</p><p>　　2.2.2.2酶添加量對胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的影響 </p><p>　　將酶濃度分別配成為1u/ml，3u/ml，5u/ml，7u/

26、ml，5u/ml，9u/ml五個梯度的懸浮液。用移液管稱取一定量的鹽酸。將反應(yīng)體系的鹽酸濃度調(diào)制pH為9，反應(yīng)溫度固定為45℃，反應(yīng)時間為1h，乙醇濃度為80%。反應(yīng)過程中，用水浴搖床震蕩，使玉米醇溶蛋白與氫氧化鈉充分反應(yīng)。按照2.2.4.2測定水解程度。按照2.2.5.3測定溶解度.</p><p>　　2.2.2.3反應(yīng)溫度對胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的影響 </p><p>　　將反應(yīng)

27、體系的鹽酸濃度調(diào)制pH為9，反應(yīng)時間為1h，乙醇濃度為80%，底物濃度5%,酶濃度5u/ml并分別在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃五個溫度梯度下反應(yīng)中，用水浴搖床震蕩，使玉米醇溶蛋白與氫氧化鈉充分反應(yīng)。按照2.2.4.2測定水解程度。按照2.2.5.3測定溶解度.</p><p>　　2.2.2.4pH對胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的影響 </p><p>　　將反應(yīng)體系的濃度分別調(diào)為

28、pH8，8.5， 9，9.5，10五個濃度梯度進(jìn)行反應(yīng)1h，而乙醇濃度為80%，溫度為45℃，底物濃度5%,酶濃度5u/ml。反應(yīng)過程中，用水浴搖床震蕩，使玉米醇溶蛋白與氫氧化鈉充分反應(yīng)按照2.2.4.2測定水解程度。按照2.2.5.3測定溶解度.。</p><p>　　2.2.3玉米醇溶蛋白水解物與金屬離子螯合能力的研究 </p><p>　　2.2.3.1 對二價鐵離子螯合能力的研究

29、[12]</p><p>　　采用Ferrozine顯色法測定二價鐵螯合能力。準(zhǔn)確吸取250 μL 1mg·mL-1的樣品溶液（樣品最終濃度為100 μg·mL-1）直接與X μL 1 mmol·L-1的FeCl2溶液混合（最終濃度為10~60 μmol·L-1，此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配FeCl2），加入一定量的超純水，使反應(yīng)體系終體積為1.5 mL?；靹蚝?，放置2 min，再加入1

30、mL 500 μmol·L-1的 Ferrozine顯色劑水溶液（Ferrozine終濃度為200 μmol·L-1），充分振蕩、混勻。混合體系在室溫下靜置10 min，使Fe2+與Ferrozine充分結(jié)合，形成Fe2+-Ferrozine復(fù)合物，然后用紫外分光光度法在562 nm條件下測吸光值。對照樣中加入一定量的EDTA鈉鹽溶液（終濃度為10 μmol·L-1）</p><p>

31、;　　2.2.3.2 對二價鋅離子螯合能力的研究[13]</p><p>　　取5 mL反應(yīng)液于燒杯中濃縮至近干，加入15 mL無水乙醇，混勻后5 000 r/min離心20 min，取沉淀并用蒸餾水定容至50 mL。用EDTA絡(luò)合滴定法測定螯合態(tài)鋅的含量。移取容量瓶中溶液20 mL至錐形瓶中，加兩滴二甲酚橙指示劑（0.5%水溶液），滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的六亞甲基四胺-鹽酸緩沖液（pH 5.0）至溶液呈穩(wěn)定的紫紅

32、色后再加入4 mL緩沖液，用已標(biāo)定的0.001 mol/L EDTA溶液滴定至溶液由</p><p>　　紫紅色變成黃色，記錄EDTA的消耗量</p><p>　　2.2.4一些重要的理化分析方法</p><p>　　2.2.4.1 蛋白質(zhì)含量—凱氏定氮法[8,11]</p><p>　　鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液配制方法—GB/T 5009.1-20

33、03；甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑配制方法—GB/T 5009.1-2003。</p><p>　　稱取0.20 g或5mL待測樣品加入到消化管中，分別稱取3.00 g硫酸鉀、0.10 g硫酸銅加入消化管，加入10mL濃硫酸，將消化管置入消化爐中消化，用小火緩慢加熱，使溶液保持在沸點以下，待泡沫消失后，加強(qiáng)火力并保持管內(nèi)液體沸騰，逐漸升溫至420 ℃，待消化管中的液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，繼續(xù)加熱30min后，自然冷

34、卻。將消化管取下，使用全自動凱氏定氮儀直接進(jìn)行蒸餾和滴定。硼酸吸收液、氫氧化鈉溶液、水加入量分別為30mL、40mL、50mL，在儀器顯示屏上讀取氮含量結(jié)果（單位mgN?g-1或mgN?mL-1），然后計算蛋白質(zhì)含量。平行試驗3次，平均值為測定結(jié)果。</p><p>　　2.2.5.2蛋白質(zhì)水解度——OPA分光光度法[6,7]</p><p>　　本研究采用OPA分光光度法測定游離氨基氮，

35、采用凱氏定氮法測定總氮的方法測定水解蛋白的水解度。</p><p><b>　　1、實驗原理</b></p><p>　　堿性條件下，OPA在β-巰基乙醇（β-MCE）存在的條件下能夠與游離氨基迅速反應(yīng)生成1-硫代-2-烷基異吲哚。此加成產(chǎn)物在340nm處有較強(qiáng)的吸收，并對所有的α-NH2吸光系數(shù)相同，另外α-NH2和ε-NH2的吸光系數(shù)也相同。運用十二烷基磺酸鈉（S

36、DS）將蛋白變性后，其吸光系數(shù)將不受影響，從而可以利用分光光光度法測定蛋白質(zhì)在水解前后的游離氨基的含量，進(jìn)而能夠計算出水解過程中釋放出的游離氨基的量。</p><p><b>　　2、試劑的配制</b></p><p>　?。?）OPA溶液：準(zhǔn)確稱取2.00g 十二烷基磺酸鈉（SDS），加入30mL 0.4moL·L-1的硼酸緩沖液（pH 9.5），水浴加熱

37、使其完全溶解，冷卻至室溫后再加入1mL 濃度為80 mg·mL-1的OPA乙醇溶液和200 μL β-巰基乙醇，最后用pH 9.5的硼酸緩沖液定容至100mL。此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。</p><p>　?。?）600μg·mL-1的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取亮氨酸0.3000 g，加入5mL 濃度為1moL·L-1的鹽酸溶液使其完全溶解，用蒸餾水定容至100mL，其濃度為3000 μg

38、83;mL-1，再取此液10mL，用蒸餾水定容至50mL，即配成600μg·mL-1的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。此溶液配成后應(yīng)及時使用或放入4℃冰箱內(nèi)保存。</p><p><b>　　3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制</b></p><p>　　取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)亮氨酸溶液，配成不同濃度的溶液（0、12、18、24、30、36μg·mL-1），再各取稀釋液3mL，與同體積

39、的OPA試劑混合并開始計時，準(zhǔn)確計時5 min，立即在340nm處測定溶液吸光值。每個濃度做3個平行，以吸光值的平均值為橫坐標(biāo)，亮氨酸濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　4、樣品中游離氨基含量和蛋白質(zhì)水解度（DH）的測定</p><p>　　將待測樣品按一定倍數(shù)稀釋后，取稀釋液3mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟，測定其吸光值。然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線所得方程，計算出樣品中游離氨基的濃度（μ

40、moL·mL-1）。水解度計算公式如下，其中計算大豆分離蛋白水解度時A=5.71；計算酪蛋白水解度時A=6.38：</p><p>　　2.2.5.3福林法測定蛋白質(zhì)含量——氮溶解指數(shù)[9]</p><p><b>　?。?）試劑的配置：</b></p><p><b>　　試劑甲：</b></p>

41、<p>　?、? %碳酸鈉溶液：稱取無水碳酸鈉（Na2CO3）20 g，定容至500 mL；</p><p>　?、?.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液；</p><p>　?、? %CuSO4·5H2O：準(zhǔn)確稱取0.5 g CuSO4·5H2O，定容至50 mL；</p><p>　　④2 %酒石酸鉀鈉：準(zhǔn)確稱取1.0 g酒

42、石酸鉀鈉，定容至50 mL。</p><p>　　使用前，分別將①與②、③與④等體積混合，再將兩混合液按50︰1比例混合，即為試劑甲。該試劑只能用一天，過期失效。</p><p>　　試劑乙：福林試劑的配置。</p><p>　　于2000 mL磨口回流裝置內(nèi)，加入鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）100 g，鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）25

43、 g，蒸餾水700 mL，85 %磷酸50 mL，濃鹽酸100 mL，文火回流10 h。</p><p>　　取去冷凝器，加入硫酸鋰（Li2SO4）50 g，蒸餾水50 mL，混勻，加入幾滴液體溴，再煮沸15 min，以驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色，需要再加幾滴溴液，再煮沸除去之。冷卻后，定容至1000mL，用漏斗過濾，置于棕色瓶中保存。此溶液使用時加1倍蒸餾水稀釋，即成已稀釋的福林試

44、劑。</p><p>　　（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的配置：</p><p>　　準(zhǔn)確稱取一定量的牛血清白蛋白，配置成0.25 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。</p><p>　?。?）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及蛋白含量的測定：</p><p>　　牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定過程及樣品蛋白質(zhì)含量測定的操作步驟如表2-2所示。按照表2-2所示的測定過

45、程，以牛血清白蛋白的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)660為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到牛血清白蛋白的質(zhì)量與吸光值A(chǔ)660關(guān)系方程。根據(jù)測定得到的待測樣品的吸光值及上述方程，計算蛋白質(zhì)含量。</p><p>　　表2-2 樣品蛋白質(zhì)含量的測定過程</p><p>　　2、氮溶解指數(shù)（NSI）的測定（GB/T 5511-2003）</p><p>　　樣品經(jīng)處理后，離心，分別測定上

46、清液和樣品中的總氮含量，并按下式計算：</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白條件優(yōu)化</p><p>　　3.1.1 反應(yīng)時間對水解度的影響</p><p>　　3.1.2 反應(yīng)溫度對水解度的影響</p><p>　　將玉米醇溶蛋白

47、用80%乙醇水溶液調(diào)配成5%的懸液，并用0.2 mol?L-1的NaOH溶液將蛋白溶液pH調(diào)至8.0，加酶量為840U/g的胰蛋白酶，分別在22℃、27℃、32℃37℃、42℃五個溫度梯度下反應(yīng)2h。反應(yīng)過程中，加入一定量的NaOH溶液，保證反應(yīng)過程中反應(yīng)體系的pH在8.0。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)容器在沸水浴中加熱10~15min，使酶失活，終止反應(yīng)。結(jié)果如圖3-2。</p><p>　　圖3-2 反應(yīng)溫度對玉米醇溶

48、蛋白水解度的影響</p><p>　　Figure 3-2 reaction temperature influence soluble protein hydrolysis degree of corn alcohol</p><p>　　從圖3-2中可以看出，在其他的條件相同的情況，反應(yīng)溫度在27℃-42℃之間，隨著

49、溫度的升高，玉米醇溶蛋白的水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在反應(yīng)溫度為27℃時，水解度為25.63%，達(dá)到最大值。當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到32℃時，水解度已經(jīng)開始下降，在此之后的幾個溫度梯度里水解度呈現(xiàn)出大致相同的下降幅度。呈現(xiàn)這種結(jié)果的原因，可能是在達(dá)到最適溫度27℃之前，隨著溫度的升高，水解反應(yīng)的速率增加，在達(dá)到最適溫度之后再提高溫度，溫度過高而是玉米醇溶蛋白構(gòu)想被破壞，從而降低了胰蛋白酶與底物的有效結(jié)合，影響酶與底物復(fù)合物的形成，使水解度下降

50、。另一個原因可能是隨溫度升高而使酶逐步變性，有活性的酶減少，從而使胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白反應(yīng)速率下降，酶構(gòu)象改變，酶活性漸漸喪失，反應(yīng)速度很快下降。因此，27℃為最適反應(yīng)溫度。</p><p>　　3.1.3 酶添加量對水解度的影響</p><p>　　將玉米醇溶蛋白用80%乙醇水溶液調(diào)配成5%的懸液，并用0.2 mol?L-1的NaOH溶液將蛋白溶液pH調(diào)至8.0，分別加入酶量為440

51、U/g、540U/g、640U/g、740U/g、840U/g五個用量梯度的胰蛋白酶，在37℃下進(jìn)行水解反應(yīng)2 h。反應(yīng)過程中，適當(dāng)加入一定量的NaOH溶液，保證反應(yīng)過程中反應(yīng)體系的pH在8.0。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)容器在沸水浴中加熱10~15min，使酶失活，終止反應(yīng)。結(jié)果如圖3-3。</p><p>　　圖3-3 酶添加量對玉米醇溶蛋白水解度的影響</p><p>　　Figure 3-

52、3 adding amount of enzyme solution influence protein hydrolysis degree of cornalcohol</p><p>　　從圖3-3中可以看出，在其他條將相同的情況，酶添加量在440U/g-840U/g之間，玉米醇溶蛋白的水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，酶添加量在640U/g時，水解度是26.76

53、%，達(dá)到最大值。當(dāng)酶添加量增加到740U/g后，水解度反而開始下降?？赡苁窃诘孜餄舛纫欢ǖ臈l件下，加酶量較低時，酶已經(jīng)與底物全部結(jié)合，所以加酶量越多水解速度越快，水解度上升明顯，但是隨著酶添加量的繼續(xù)增加，反應(yīng)體系中酶的濃度過高，酶與酶之間產(chǎn)生了競爭性抑制，導(dǎo)致了酶量增加，水解度卻不再增加甚至降低。因此，酶添加量的最適條件是640U/g。</p><p>　　3.1.4 底物濃度對水解度的影響</p>

54、<p>　　將玉米醇溶蛋白用80%乙醇水溶液分別調(diào)配成1%、3%、5%、7%、9%五個濃度梯度的懸液，并用0.2 mol?L-1的NaOH溶液將蛋白溶液pH調(diào)至8.0，加酶量為840U/g的胰蛋白酶，在37℃下進(jìn)行水解反應(yīng)2 h。反應(yīng)過程中，適當(dāng)加入一定量的NaOH溶液，保證反應(yīng)過程中反應(yīng)體系的pH在8.0。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)容器在沸水浴中加熱10~15min，使酶失活，終止反應(yīng)。結(jié)果如圖3-4。</p>&

55、lt;p>　　圖3-4 底物濃度對玉米醇溶蛋白水解度的影響</p><p>　　Figure 3-4 substrate concentration effect of solution protein hydrolysis degree of corn alcohol</p><p>　　從圖3-4中可以看出，在其他條將相同的情況，

56、底物濃度在1%-9%之間，玉米醇溶蛋白的水解度隨著底物濃度的增加呈現(xiàn)向上升后下降的趨勢，底物濃度在7%時，水解度是20.05%，達(dá)到最大值。當(dāng)?shù)匚餄舛瘸^7%，水解度反而下降。對該結(jié)果分析原因，應(yīng)該是由于酶添加量相同時，隨著底物濃度的增加，水解較快，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定濃度以后，玉米醇溶蛋白的含量較高，粘性較大，蛋白不能充分浸潤，胰蛋白酶與玉米醇溶蛋白不能完全接觸，影響了胰蛋白酶對玉米醇溶蛋白的作用。在較低底物濃度時，隨著底物濃度增加，蛋

57、白質(zhì)水解度和降解率都逐漸增大，這是因為隨著底物濃度增加，胰蛋白酶與底物蛋白分子態(tài)間的接觸幾率增加，使可水解的肽鍵數(shù)增加，但底物濃度增加到一定程度后再繼續(xù)增加，水解度下降。因此，水解反應(yīng)的底物濃度以7%為最適底物濃度。</p><p>　　3.1.5 乙醇濃度對水解度的影響</p><p>　　將玉米醇溶蛋白分別用70%、75%、80%、85%、90%五個濃度的乙醇水溶液分別調(diào)配成5%的懸液

58、，并用0.2 mol?L-1的NaOH溶液將蛋白溶液pH調(diào)至8.0，加酶量為840U/g的胰蛋白酶，在37℃下進(jìn)行水解反應(yīng)2 h。反應(yīng)過程中，適當(dāng)加入一定量的NaOH溶液，保證反應(yīng)過程中反應(yīng)體系的pH在8.0。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)容器在沸水浴中加熱10~15min，使酶失活，終止反應(yīng)。結(jié)果如圖3-5。</p><p>　　圖3-5 乙醇濃度對玉米醇溶蛋白水解度的影響</p><p>　　Fi

59、gure 3-5 the concentration of ethanol soluble protein hydrolysis degree of corn alcohol</p><p>　　從圖3-5中可以看出，其他條件相同的情況，當(dāng)乙醇濃度在70%-90%之間時，玉米醇溶蛋白的水解度呈現(xiàn)出先上升后下降然后趨于平緩的趨勢。反應(yīng)之處，水解度

60、隨著乙醇濃度的增加而升高，當(dāng)乙醇濃度增加到75%是，水解度是23.52%，達(dá)到最大值。當(dāng)乙醇濃度超過75%時，水解度隨著乙醇濃度的增加而降低，當(dāng)乙醇濃度超過80%以后，水解度趨于平緩趨勢。根據(jù)資料，玉米醇溶蛋白溶于70%-92%的乙醇中，不溶于水和無水乙醇，故過低的乙醇濃度或較高的乙醇濃度不利于玉米醇溶蛋白的溶解，即不利于胰蛋白酶與玉米醇溶蛋白結(jié)合，所以水解度較低。但是同時胰蛋白酶在乙醇溶液中也會發(fā)生變性，太高濃度的乙醇溶液會影響胰蛋白

61、酶的作用性質(zhì)，從而也會導(dǎo)致水解度的下降。因此，水解反應(yīng)的乙醇濃度以75%為最適反應(yīng)濃度。</p><p>　　綜上，胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的最適反應(yīng)條件為：反應(yīng)時間2h，反應(yīng)溫度27℃，酶添加量640U/g，玉米醇溶蛋白底物濃度為7%，乙醇濃度為75%。根據(jù)上述最適的反應(yīng)條件，反應(yīng)分別進(jìn)行不同時間并制備具有不同水解度的玉米醇溶蛋白產(chǎn)物，制備結(jié)果如下：反應(yīng)時間分別控制在1h、2h，制備出水解度分別為21.63 %

62、、26.76%的玉米醇溶蛋白水解產(chǎn)物。</p><p>　　3.3 玉米醇溶蛋白及水解物與Zn2+螯合能力的測定</p><p>　　將未反應(yīng)的蛋白質(zhì)和上述實驗制備的兩種玉米醇溶蛋白的水解產(chǎn)物進(jìn)行與Zn2+螯合能力的測定。</p><p>　　樣品鋅離子螯合能力的測定參照Wang等[11]的方法，計算方法略有改動。</p><p>　　鋅-肽

63、螯合反應(yīng)：取1.0 mL 0.05 mol/L ZnSO4（乙醇溶解）于25 mL離心管中，緩慢滴入10 mL 0.14%（w/v）的樣品溶液（用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶解），室溫下攪拌反應(yīng)1 h，至有白色沉淀生成。</p><p>　　肽螯合鋅含量的測定：取5 mL反應(yīng)液于燒杯中濃縮至近干，加入15 mL無水乙醇，混勻后5 000 r/min離心20 min，取沉淀并用蒸餾水定容至50 mL。用EDTA絡(luò)合滴定

64、法測定螯合態(tài)鋅的含量。移取容量瓶中溶液20 mL至錐形瓶中，加兩滴二甲酚橙指示劑（0.5%水溶液），滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的六亞甲基四胺-鹽酸緩沖液（pH 5.0）至溶液呈穩(wěn)定的紫紅色后再加入4 mL緩沖液，用已標(biāo)定的0.001 mol/L EDTA溶液滴定至溶液由紫紅色變成黃色，記錄EDTA的消耗量。根據(jù)EDTA的消耗量計算出與Zn2+螯合能力。結(jié)果如圖3-7。</p><p>　　圖中：玉米醇溶蛋白1水解度21

65、.63%； 玉米醇溶蛋白2水解度26.76%</p><p>　　圖3-7 不同水解度的玉米醇溶蛋白與Zn2+螯合能力</p><p>　　Figure 3-7 Zn2+ chelating ability of different degree of hydrolysis of corn alcohol</p><p>　　

66、從圖3-7中可以看出，同一種蛋白質(zhì)在不同水解度的情況下，與Zn2+螯合能力有一定差異。隨著玉米醇溶蛋白水解度的增加，各自與Zn2+螯合能力呈升高趨勢。未參與反應(yīng)的玉米醇溶蛋白與Zn2+螯合能力是0.11，最適條件下水解1h后的玉米醇溶蛋白的水解產(chǎn)物與Zn2+螯合能力是0.18，最適條件下水解2h后的玉米醇溶蛋白的水解產(chǎn)物與Zn2+螯合能力是0.26。分析其原因，可能是水解程度越大，多肽暴露出來的能夠與Zn2+結(jié)合的基團(tuán)越多，所以與Zn2

67、+螯合能力越強(qiáng)。玉米醇溶蛋白分子中的大量氨基及部分酰胺基的存在，能夠選擇性地配位或吸附一些金屬離子，尤其是對過渡金屬離子具有較好的螯合能力，例如Zn2+。水解后的醇溶蛋白的氨基部分也隨之增多，與Zn2+的螯合能力顯著增強(qiáng)。</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　玉米醇溶蛋白分子中的大量氨基及部分酰氨基的存在，能夠選擇性地配位或吸附一些金屬離子，

68、尤其是對過渡金屬離子具有較好的螯合能力，食品領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[21]。但是，由于大分子鏈的影響，使配位基與金屬離子配位受到一定的空間阻礙。為提高吸附量，選擇對玉米醇溶蛋白進(jìn)行水解反應(yīng)，高選擇性的重金屬離子配位吸附劑，以Zn2+為模板，采用先使玉米醇溶蛋白與金屬離子在均相中配位反應(yīng)，制得玉米醇溶蛋白與Zn2+螯合物。</p><p>　　本實驗中，首先要研究胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的最適條件，通過單因素反應(yīng)，得

69、出結(jié)論，最終確定的最適反應(yīng)條件為：反應(yīng)時間2h，反應(yīng)溫度27℃，酶添加量640U/g，玉米醇溶蛋白底物濃度為7%，乙醇濃度為75%。在上述的反應(yīng)條件下，制備出水解度為26.76%的水解后的玉米醇溶蛋白產(chǎn)物。</p><p><b>　　5.結(jié)論</b></p><p>　　本試驗主要是以玉米醇溶蛋白為底物，采用胰蛋白酶對玉米醇溶蛋白進(jìn)行水解試驗，使整個反應(yīng)體系保持恒定

70、不變?yōu)?0毫升。通過對水解反應(yīng)過程中反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、酶添加量、底物濃度以及乙醇濃度等條件進(jìn)行單因素反應(yīng)，從而確定出最適反應(yīng)條件。胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的最適反應(yīng)條件為：反應(yīng)時間2h，反應(yīng)溫度27℃，酶添加量640U/g，玉米醇溶蛋白底物濃度為7%，乙醇濃度為75%。在上述的反應(yīng)條件下，制備出水解度為26.76%的玉米醇溶蛋白水解產(chǎn)物。將玉米醇溶蛋白及玉米醇溶蛋白水解物與Zn2+螯合，發(fā)現(xiàn)玉米醇溶蛋白被胰蛋白酶水解以后提高了與Zn2

71、+螯合能力，可以擴(kuò)大玉米醇溶蛋白在食品中的應(yīng)用范圍。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1，10，12，13，14]段純明，董海洲.玉米醇溶蛋白的特性及研究[J].糧食與食品工業(yè)，2007(14)：3—28</p><p>　　[2，11]杜悅，陳野，王冠禹等.玉米醇溶蛋白的提取及其應(yīng)用[J].農(nóng)產(chǎn)品加工

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79、gt;<p><b>　　致 謝</b></p><p>　　本文的立題、實驗設(shè)計、論文撰寫，都得到了李丹老師的悉心指導(dǎo)，導(dǎo)師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度令我受益匪淺，在老師的悉心指導(dǎo)下我終于順利完成了畢業(yè)論文，在此，衷心感謝我的論文指導(dǎo)老師李丹老師。還要感謝課題完成過程中給予我?guī)椭c指導(dǎo)的各位老師和同學(xué)們，在此一并感謝。</p><p>　　在我即將完成本科學(xué)業(yè)之