Development and Validation of Antigen Capture Elisa for Detection of Group-a Porcine Rotavirus.pdf

1、輪狀病毒，屬于呼腸孤病毒科，是一種能夠引起嬰兒和大量新生動物脫水性腹瀉和高死亡率的人畜共患病毒。其中，A群輪狀病毒感染常見于地方性和廣泛流行的病例中，可以導致斷奶前后仔豬的大量經濟損失，主要表現為體重減輕、高發(fā)病率和死亡率。據報道，輪狀病毒可以通過種間傳播，并造成嚴重的公共衛(wèi)生問題。本研究的目的是建立一種快速、高敏感性和特異性的ELISA方法檢測豬輪狀病毒，隨后開展了流行毒株基因型的調查。
　　1.豬輪狀病毒VP6基因的克隆表達<

2、br>　　輪狀病毒的基因組由11個節(jié)段雙鏈RNA組成，三層結構，非囊膜，病毒粒子直徑為100nm?；蚪M的第6節(jié)段編碼中間的衣殼蛋白VP6，VP6基因在哺乳動物的A群輪狀病毒中具有高度同源性（約87-92％）;因此，其在A群輪狀病毒的診斷中具有重要意義。通過PCR的方法從我國豬A群輪狀病毒TM-a株中克隆VP6基因，構建重組質粒pGEX-KG-VP6，并將其導入原核表達菌株JM105中，IPTG誘導蛋白表達，純化后的重組蛋白約為70kD

3、a，最后利用該重組蛋白免疫小鼠以及實驗兔，分別制備單克隆和多克隆抗體。
　　2.AC-ELISA方法的建立
　　(1)多克隆抗體的制備
　　用弗氏完全佐劑乳化的100μg VP6蛋白免疫四周齡BALB/c小鼠，之后每隔兩周，用相同劑量的弗氏不完全佐劑乳化的VP6蛋白加強免疫3次。在細胞融合試驗前3天腹腔注射相同劑量的VP6蛋白。選擇高抗體滴度的小鼠進行細胞融合試驗。從小鼠脾臟中分離脾細胞，并將其與Sp2/0骨髓瘤細胞融

4、合（比例為5∶1），獲得雜交瘤細胞。利用間接ELISA，western-blot和間接免疫熒光試驗篩選抗VP6和豬A群輪狀病毒的陽性雜交瘤細胞。用間接ELISA的方法篩選到了兩株對VP6蛋白和豬A群輪狀病毒均有強反應原性的雜交瘤細胞，而且能夠分泌單克隆抗體Mab1A7(IgG1)和3F5(IgG2a)。其中，3F5抗體滴度(1∶25600)是1A7抗體滴度(1∶12800)的兩倍。將雜交瘤細胞通過腹腔注射的方式注入BALB/c小鼠體內，

5、10天之后，收集腹腔液，用飽和的硫酸銨溶液純化IgG，再用透析和親和柱層析的方法純化該蛋白，最后，用western blot和間接免疫熒光方法進一步證實其反應原性。
　　(2)兔抗VP6多克隆抗體的制備
　　用相同體積弗氏完全佐劑(FCA)乳化純化的1mg（1mg/ml）VP6蛋白，分點皮下注射新西蘭白兔，兩周之后，用相同劑量的弗氏不完全佐劑(FIA)乳化的VP6蛋白加強免疫一次，十天之后，第三次加強免疫，之后收集血清，用間

6、接ELISA方法檢測抗體滴度，其中抗原包被板包被的VP6蛋白量為1μg每孔。利用商業(yè)化的親和層析柱純化多克隆抗體。
　　(3)抗原捕獲ELISA方法的建立
　　用抗VP6的蛋白作為陽性對照，利用棋盤滴定法篩選兔抗VP6多抗，鼠抗VP6單抗和HRP-羊抗鼠單抗的最佳抗體滴度。用100μl含250ng兔抗VP6蛋白多抗的包被液（0.05M碳酸鈉-碳酸氫鈉，pH9.6）包被整個聚苯乙烯微量滴定96孔板，使用200μl的封閉液（磷酸

7、鹽緩沖液稀釋的3％ BSA+0.05％吐溫-20; PBST）覆蓋空白區(qū)域和阻斷非特異性反應。96孔板使用50μl/孔、10％(w/v)含PoRV的糞便上清孵育，鼠抗VP6單抗使用封閉液稀釋(1％BSA)，HRP羊抗鼠IgG(ABclonal，USA)按1∶10000的稀釋比例稀釋，每孔100μl，上述每一步于37℃作用1h，并用洗滌液(PBST)洗滌4次，最后，每孔加100μl TMB顯色，使用ELx800 Absorbance Re

8、ader(BioTek，Winooski，VT，USA)測量波長為630nm時的吸光值。使用25頭A群輪狀病毒陰性豬的糞便樣品檢測，以0D平均值加3倍標準差作為判定臨界值。結果顯示AC-ELISA的檢測靈敏度與常規(guī)RT-PCR相同（約102.5 TCID50/ml）。為了驗證建立的AC-ELISA方法，從中國不同省份的豬場中共收集了295份豬腹瀉糞便樣品，用該檢測方法與傳統RT-PCR以及RT-qPCR對比，結果，該方法的敏感性和特異性

9、與RT-qPCR的符合率分別為91.67％和100％，因此，這兩種方法的檢測結果具有高度的一致性(kappa=0.972)。AC-ELISA，傳統RT-PCR和RT-qPCR的樣品檢出率分別為11.2％，11.5％和12.2％，三種檢測方法之間沒有顯著性差異。此外，AC-ELISA檢測方法在流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、偽狂犬病毒和豬圓環(huán)病毒2型之間沒有交叉反應。試驗結果顯示建立的AC-ELISA方法具有快速、高特異性和高敏感性的特

10、點，可以用于豬場輪狀病毒病的大規(guī)模監(jiān)控和臨床快速檢測。
　　3.基于多抗的AC-ELISA方法的建立
　　試驗也構建了一種檢測豬A群輪狀病毒的簡易、快速、低成本、高度特異性和敏感性的抗VP6蛋白和PoRVA(RVA/Pig-wt/CHN/TM-a/2011/G9P23)的多克隆抗體。用間接ELISA、western-blot和間接免疫熒光的方法驗證了該多克隆抗體的檢測效率。AC-ELISA方法檢測PoRVA蛋白的閾值為50n

11、g/mL。用AC-ELISA，RT-qPCR和商業(yè)化的輪狀病毒AC-ELISA檢測試劑盒檢測了295份豬腹瀉樣品，結果顯示，AC-ELISA方法的敏感性與特異性RT-qPCR相比陽性檢出率分別為94.4％和100％。另外，AC-ELISA在檢測PEDV，TGEV，PRV和PCV2等病毒時沒有任何交叉反應，因此，AC-ELISA方法可以有效的檢測臨床樣品的豬A群輪狀病毒。
　　4.當前豬輪狀病毒基因型的鑒定
　　目前，具有G5

12、和P[7]組合的PoRVA主要在仔豬中流行。然而，最近的研究已經證明，在人和仔豬中共有的G基因型PoRVA正在全世界出現。然而，目前還沒有關于中國不同G基因型PoRVA所占比例的研究。因此，2015年1月至2016年6月，試驗一共從中國16個省的40個豬場收集了295個由腹瀉仔豬糞便組成的臨床樣本。在這40個豬場中，有15個豬場檢測到了輪狀病毒(37.7％)。輪狀病毒可以在一年任意月份穩(wěn)定檢測到，且不同月份之間沒有顯著差異。從中成功測序

13、了17個樣品，對總共67種網上來源和背景清楚的中國PoRVA毒株（包括在本研究中檢測的17種毒株的VP7序列和從GeneBank下載的49種）的VP7基因進行系統進化樹分析。在13個G9基因型中，12個毒株與PoRVA YNR毒株同源性高(99％)。結果表明，在本研究中17個分離的毒株中，G9型(76.5％，13/17)是最多見的基因型，其次是G5(17.6％，3/17)和G11(5.9％，1/17)型。此外，67株RVA的VP7序列將