小麥AGPase質(zhì)體型小亞基的克隆及其遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)從冬小麥豫教2號(hào)籽粒中克隆了ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose phrophosphorylase，AGPase）質(zhì)體型小亞基（plastidial small subunit，SSUⅡ， GenBank序列號(hào)：EU586278）的cDNA序列，發(fā)現(xiàn)此基因的5’端缺失了一段114 bp序列，并探討了此基因的組織特異性表達(dá)和灌漿期間的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它可能與小麥籽粒淀粉積累密切相關(guān)。為了通過(guò)基因工程技術(shù)提高小麥粒重，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)

2、建了SSUⅡ過(guò)表達(dá)載體，并通過(guò)花粉管通道法進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了經(jīng)PCR鑒定呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株的AGPase活性和粒重均明顯高于未轉(zhuǎn)化植株。主要結(jié)論為： 1．利用RT-PCR方法克隆了冬小麥豫教2號(hào)籽粒內(nèi)SSUⅡ基因，克隆基因SSUⅡ的cDNA片段為1631 bp，編碼區(qū)為1428 bp，位于第9-1436 bp之間。cDNA序列同源性比較結(jié)果表明，與GenBank上已報(bào)道的大麥SSUⅡ基因（248563）同源性為8

3、3．2％；在中間及3’端序列，二者同源性高達(dá)97％。但在EU586278的5’端缺少一段114 bp序列，這是造成其與其它SSUⅡ同源性較低的原因。由于缺失部分位于編碼域內(nèi)，因此預(yù)測(cè)EU586278編碼的蛋白質(zhì)分子量（52．01 kDa）與等電點(diǎn)（5．48）均小于大麥SSUⅡ（Z48563）編碼的蛋白質(zhì)分子量（56．05 kDa）與等電點(diǎn)（6．11）。 2．同源性比較結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)克隆的冬小麥SSUⅡ氨基酸序列的中間部分與C端

4、與其它高等植物的SSUⅡ高度同源，由于5'端cDNA的一段缺失造成其N(xiāo)端的轉(zhuǎn)移肽明顯變短（僅為25個(gè)氨基酸，而其它作物SSUⅡ轉(zhuǎn)移肽序列長(zhǎng)度為58-70個(gè)氨基酸，缺失率高達(dá)60．9％）。植物SSUⅡ之間的差異主要集中在轉(zhuǎn)移肽上，將本實(shí)驗(yàn)所克隆的EU586278 N端轉(zhuǎn)移肽氨基酸序列與已報(bào)道大麥的SSUⅡ（Z48563）、小麥的SSUⅡ（AF536819）、玉米的SSUⅡ（AF334960）等進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)EU586278與其它SS

5、UⅡ之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性只有52％-33％，表明EU586278與上述已發(fā)現(xiàn)的基因序列差異較大，是一個(gè)新的SSUⅡ基因。 3．為了探明EU586278轉(zhuǎn)移肽缺失的機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)從冬小麥品種豫教2號(hào)擴(kuò)增SSUⅡ5'端缺失片段對(duì)應(yīng)的基因組DNA序列（FJ907395）片段為1146 bp，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FJ907395含有缺失的cDNA序列。這表明EU586278cDNA序列上大片段的缺失不是發(fā)生在DNA水平，而是出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平。

6、 4．通過(guò)半定量PCR法，發(fā)現(xiàn)SSUⅡ基因在葉片中表達(dá)量最高，在莖和籽粒中的表達(dá)量次之，在根中的表達(dá)量最低。在籽粒灌漿期間，豫教2號(hào)和蘭考矮早8兩個(gè)大粒型小麥品種籽粒內(nèi)SSUⅡ基因的表達(dá)均與籽粒淀粉合成速率變化趨勢(shì)一致，表明SSUⅡ在籽粒淀粉合成中發(fā)揮著重要作用。 5．為了通過(guò)基因工程提高籽粒淀粉合成速率，進(jìn)一步提高小麥粒重和產(chǎn)量，我們構(gòu)建了SSUⅡ的過(guò)表達(dá)載體，并通過(guò)花粉管通道法進(jìn)行了小麥的遺傳轉(zhuǎn)化研究，從中得到了經(jīng)PCR