馬鈴薯Y病毒P1、HC-Pro、P3、CI基因介導(dǎo)的病毒抗性的比較研究.pdf

1、馬鈴薯Y病毒(Potata virus Y，PVY)是馬鈴薯Y病毒屬中的典型種，對馬鈴薯、煙草等重要經(jīng)濟(jì)作物危害相當(dāng)嚴(yán)重，特別是PVY壞死株系(PVYN)可以造成寄主提前死亡而絕產(chǎn)。RNA介導(dǎo)的病毒抗性是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)，是近年來發(fā)展起來的一種有效防治植物病毒病害的策略。它是以病毒核酸片段為轉(zhuǎn)基因而誘導(dǎo)的基因沉默，不但能將轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物降解，而且能將

2、入侵的與轉(zhuǎn)基因同源的病毒基因組RNA降解，具有抗病程度高(近乎免疫)、抗性持久及生物安全性高等優(yōu)點。馬鈴薯Y病毒各基因編碼的產(chǎn)物在病毒的復(fù)制和增殖過程中，表現(xiàn)為不同的功能，因此推測不同的功能基因介導(dǎo)的病毒抗性可能存在差異。目前病毒的衣殼蛋白基因、復(fù)制酶基因和移動蛋白基因等均有RNA介導(dǎo)抗性的報道，但尚缺少系統(tǒng)的比較研究。 本研究采用RT-PCR技術(shù)，克隆馬鈴薯Y病毒壞死株系(PVYN)的P1、HC-Pro、P3、CI基因，進(jìn)一步

3、亞克隆了P1、HC-Pro、P3、CI基因的3'端cDNA區(qū)段，構(gòu)建莖長度400bp、環(huán)長度為100bp的hpRNA結(jié)構(gòu)植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草，進(jìn)行抗性鑒定。研究結(jié)果表明馬鈴薯Y病毒P1、HC-Pro、P3、CI基因介導(dǎo)的病毒抗性存在比較明顯的差異。具體結(jié)果如下： 1.Trizol法提取感染PVY的煙草葉片的總RNA，采用RT-PCR的方法克隆了馬鈴薯Y病毒基因組P1、HC-Pro、P3、CI4個基因片段。序列已登錄GenBan

4、k，登錄號為：EU182576。 2.以P1、HC-Pro、P3、CI基因區(qū)段cDNA為模板，PCR分別擴(kuò)增各基因3'端400bp和500bpcDNA區(qū)段，以pROKII為載體構(gòu)建了莖長度為400bp、環(huán)長度為100bp的hpRNA結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體pROK II-P1、pROK II-HC-Pro、pROK II-P3和pROK II-CI。 3.將所構(gòu)建的表達(dá)載體pROKII-P1、pROKII-HC-Pro、pRO

5、KII-P3、pROK II-CI利用凍融法直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。菌液PCR及酶切鑒定證明重組質(zhì)粒均已成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株。 4.葉盤法轉(zhuǎn)化煙草NC89。經(jīng)卡那霉素篩選和PCR檢測，共獲得轉(zhuǎn)pROK II煙草40株(對照)，轉(zhuǎn)pROK II-P1煙草90株、轉(zhuǎn)pROK II-HC-Pro煙草108株、轉(zhuǎn)pROK II-P3煙草94株、轉(zhuǎn)pROKII-CI煙草96株。 5.以感染PVYN煙草葉片的汁液為接種物，汁液摩

6、擦接種轉(zhuǎn)基因煙草。通過癥狀觀察及ELISA檢測表明不同的轉(zhuǎn)基因植株對PVYN的抗性比例存在差異。在90株轉(zhuǎn)pROKII-P1的T0代煙草中，有54株表現(xiàn)高度抗病，抗性比例為60.00％；在108株轉(zhuǎn)pROK II-HC-Pro的T0代煙草中，有36株表現(xiàn)高度抗病，抗性比例為33.33％；在100株轉(zhuǎn)pROK II-P3的T0代煙草中，有54株表現(xiàn)高度抗病，抗性比例為57.45％；在96株轉(zhuǎn)pROKII-CI的T0代煙草中，有51株表現(xiàn)高