川陜哲羅鮭種群遺傳學(xué)及分子系統(tǒng)發(fā)育研究.pdf

1、哲羅鮭屬（Hucho）隸屬于鮭形目(Salmoniformes)、鮭科(Salmonidae)。全世界現(xiàn)有5個(gè)種，即:分布于歐洲多瑙河流域的多瑙哲羅鮭(Hucho hucho);廣泛分布于歐亞大陸北部的太門哲羅鮭(Hucho taimen);分布于我國長江水系的川陜哲羅鮭（Hucho bleekeri）;分布于我國和朝鮮鴨綠江上游的石川哲羅鮭（Hucho ishikawae）;以及分布于庫頁島、日本北海道和遠(yuǎn)東地區(qū)的遠(yuǎn)東哲羅鮭(Huch

2、o perryi)。它們在生物地理學(xué)、魚類系統(tǒng)演化與古生態(tài)學(xué)的研究中具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值。
　　川陜哲羅鮭又名四川哲羅鮭，是哲羅鮭屬中唯一的我國特有物種。20世紀(jì)60年代以前，川陜哲羅鮭分布較為廣泛，資源量較豐富。近年來由于生態(tài)環(huán)境的破壞、過度捕撈等人為因素，川陜哲羅鮭自然資源量經(jīng)歷了極為嚴(yán)重的下降，原有的分布區(qū)內(nèi)已經(jīng)多年未發(fā)現(xiàn)其蹤跡，自然種群面臨滅絕的威脅。2012年秋季在陜西太白河重新發(fā)現(xiàn)了19尾川陜哲羅鮭成魚，是近20多年來發(fā)

3、現(xiàn)的規(guī)模最大的一批群體，也是該物種在太白河絕跡15年后的再次發(fā)現(xiàn)。對此，科研工作者立刻開啟了該物種的保護(hù)計(jì)劃。保護(hù)遺傳學(xué)的重要研究內(nèi)容是保護(hù)物種的遺傳多樣性，從分子生物學(xué)的角度來評估物種多樣性水平是恢復(fù)其野生資源的前提和基礎(chǔ)?；诜N群遺傳學(xué)的研究結(jié)果制定相應(yīng)的保護(hù)對策是保護(hù)瀕危物種的有效手段。本文以川陜哲羅鮭為主要研究對象，一方面開展種群遺傳學(xué)研究，篩選出適用于川陜哲羅鮭的高效分子標(biāo)記，評估了川陜哲羅鮭種群遺傳多樣性，并構(gòu)建了親子鑒定體

4、系，同時(shí)研究了川陜哲羅鮭的基因滲入問題。另一方面探完了該哲羅鮭屬物種的系統(tǒng)進(jìn)化與分化過程，研究了川陜哲羅鮭的系統(tǒng)發(fā)育位置和分歧時(shí)間。具體研究結(jié)果如下:
　　1川陜哲羅鮭微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)
　　通過二代技術(shù)獲得秦嶺細(xì)鱗鮭(Brachymystax lenok tsinlingensis)微衛(wèi)星文庫，進(jìn)一步篩選出適用于川陜哲羅鮭的多態(tài)微衛(wèi)星引物27對，并使用該微衛(wèi)星標(biāo)記對20尾野生川陜哲羅鮭個(gè)體進(jìn)行了遺傳多樣性初步研究。結(jié)果表明:

5、等位基因數(shù)目(Na)為2～8個(gè)，觀測雜合度(Ho)為0.150～0.906，期望雜合度(He)為0.508～0.845，多態(tài)信息含量(PIC)為0.371～0.808。其中8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(BLT19，BLT28，BLT25，BLT30，Hbl3-5，Hbl5-11，Hbl6-240，Hbl8-163)顯著偏離哈迪溫伯格平衡(P＜0.01)。本實(shí)驗(yàn)研究開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記可應(yīng)用于川陜哲羅鮭個(gè)體識別、遺傳多樣性、親緣關(guān)系鑒定等遺傳學(xué)的進(jìn)一步研究

6、。
　　2基于線粒體DNA（CYTB基因片段和控制區(qū)序列）和微衛(wèi)星標(biāo)記對川陜哲羅鮭太白河野生種群遺傳多樣性的評估
　　線粒體DNA標(biāo)記:采集川陜哲羅鮭野生個(gè)體43尾，分別利用線粒體DNA不同片段（CYTB基因片段和控制區(qū)序列）對該種群進(jìn)行遺傳多樣性評估。結(jié)果顯示:控制區(qū)序列擁有12個(gè)單倍型，CYTB基因片段則僅擁有3個(gè)單倍型;控制區(qū)序列的單倍型多樣性指數(shù)（Hd）與核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）分別為0.8208和0.00159，遠(yuǎn)

7、高于CYTB基因片段（0.0941和0.00009）。兩個(gè)序列的核苷酸變異的平均數(shù)分別為1.871（控制區(qū)序列）和0.095（CYTB基因片段）?？傮w來說，兩序列的遺傳多樣性水平都較低。Network網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖表明該群體的線粒體DNA單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較為單一。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明本實(shí)驗(yàn)中來自陜西省太白河的樣本全部歸為一個(gè)類群，該種群沒有呈現(xiàn)出明顯的遺傳分化。
　　微衛(wèi)星標(biāo)記:從篩選出的多態(tài)微衛(wèi)星引物中挑選出15對多態(tài)性高、擴(kuò)增效果好的引

8、物，分別在正向引物末端標(biāo)記2種常見的熒光(FAM或HEX)，利用其對川陜哲羅鮭野生種群進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果共檢測到77個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)從2(Hbl10-16)到13(Hbl8-163)不等。觀測雜合度0.04651～1.0000，平均值為0.59719。期望雜合度0.09111～0.67387，平均值為0.44735。除位點(diǎn)Hbl4-10，BLT25，Hbl3-5和Hbl2-2外，其他位點(diǎn)都顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P

9、＜0.01)。近交系數(shù)為-0.90487～0.49398，平均值-0.34033(P＞0.05)。所有檢測的微衛(wèi)星位點(diǎn)間不存在連鎖不平衡現(xiàn)象(P＞0.05)。聚類分析表明該種群內(nèi)不存在遺傳分化。種群瓶頸效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果說明該種群近期經(jīng)歷了嚴(yán)重的瓶頸效應(yīng)，并達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。
　　兩種分子標(biāo)記結(jié)果都顯示:太白河川陜哲羅鮭野生種群具有較低的遺傳多樣性。
　　3川陜哲羅鮭人工繁殖子一代遺傳特征的評估及親子鑒定技術(shù)的建立

10、r>　　從篩選出的多態(tài)微衛(wèi)星引物中選擇出14個(gè)高度多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)合成熒光標(biāo)記引物，對川陜哲羅鮭人工繁殖子一代群體進(jìn)行遺傳多樣性評估。結(jié)果顯示，該群體共檢測到有49個(gè)等位基因，單個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)(Na)為2～6個(gè)，平均值為3;觀測雜合度(Ho)為0.069～1.000，其平均值為0.574;期望雜合度(He)為0.067～0.696，平均值為0.432;多態(tài)信息含量(PIC)為0.064～0.644，平均值0.339。這些參數(shù)值均表明該群

11、體的遺傳多樣性處于較低水平。兩兩家系之間的遺傳分化程度（FST）為0.02504，表明家系之間的遺傳距離較為接近，不存在明顯的遺傳分化。單個(gè)種群內(nèi)近交系數(shù)(FIS)為-0.33255，說明群體未出現(xiàn)明顯的近交。與川陜哲羅鮭野生種群相比，子一代群體的遺傳多樣性參數(shù)明顯較低，利用這14對引物構(gòu)建川陜哲羅鮭親子鑒定技術(shù)。結(jié)果顯示，在單親信息已知和雙親信息已知的情況下，其累積非父排除概率均大于99％;雙親信息均未知情況下，累積非父排除概率大于9

12、8％，可以認(rèn)定親本與子代之間的親子關(guān)系。分析結(jié)果表明這14個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記適用于建立川陜哲羅鮭親子鑒定技術(shù)。
　　4基于線粒體DNA CYTB基因片段分析秦嶺地區(qū)川陜哲羅鮭與秦嶺細(xì)鱗鮭基因漸滲
　　利用線粒體DNA細(xì)胞色素b基因CYTB片段，分析了陜西秦嶺地區(qū)太白河川陜哲羅鮭與秦嶺細(xì)鱗鮭兩個(gè)種群樣本的遺傳特征，其中川陜哲羅鮭樣本量為43尾，秦嶺細(xì)鱗鮭樣本量為50尾。同時(shí)將其與青海省瑪柯河川陜哲羅鮭及黑龍江流域的細(xì)鱗鮭歷史數(shù)據(jù)

13、進(jìn)行序列比對與聚類分析。結(jié)果顯示，總?cè)后w的簡約信息位點(diǎn)數(shù)為97，太白河川陜哲羅鮭與秦嶺細(xì)鱗鮭兩個(gè)群體之間的遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.06653，平均核苷酸差異度(Kxy)為0.3476、核苷酸歧異度(Dxy)為0.08598、基因流(Nm)為3.51?？?cè)后w的固定系數(shù)(Fst)為0.1080，兩個(gè)群體沒有共同單倍型。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示兩個(gè)群體各自聚為一類，二者之間的遺傳距離較遠(yuǎn)。研究結(jié)果表明這兩種鮭科魚類在所分析的線粒體DNA區(qū)域內(nèi)沒有發(fā)

14、生雜交漸滲。
　　5川陜哲羅鮭分子系統(tǒng)發(fā)育位置及分歧年代的研究
　　利用線粒體DNA序列全長和13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因分別構(gòu)建了鮭科魚類（包括部分鮭科魚類及除石川哲羅鮭外其他哲羅鮭屬魚類）系統(tǒng)進(jìn)化樹;同時(shí)利用線粒體DNA全長序列和13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因拼接序列，基于恒定進(jìn)化速率的分子鐘推斷哲羅鮭屬分化年代。結(jié)果發(fā)現(xiàn)哲羅鮭屬魚類系統(tǒng)進(jìn)化中，川陜哲羅鮭與多瑙哲羅鮭和太門哲羅鮭聚為一類，遠(yuǎn)東哲羅鮭與紅點(diǎn)鮭屬物種的分支更為接近。研究結(jié)果的

15、系統(tǒng)進(jìn)化樹大部分節(jié)點(diǎn)的后驗(yàn)概率大于95％，因此該聚類分析具有較高的可信度。
　　哲羅鮭屬分化年代分析推測遠(yuǎn)東哲羅鮭最先與哲羅鮭屬其他魚類分離，隔離年代大概為10.4 Ma，這種分化可能是地理隔離造成的。分布于歐亞大陸淡水水系的太門哲羅鮭、川陜哲羅鮭與多瑙哲羅鮭則分化年代較晚。川陜哲羅鮭同太門哲羅鮭以及多瑙哲羅鮭的隔離時(shí)間均約為1.7～2.2 Ma,多瑙哲羅鮭與太門哲羅鮭的隔離時(shí)間則約為1.4～1.8 Ma?，旂婧哟冋芰_鮭與太白河