水稻質(zhì)膜質(zhì)子泵基因?qū)Φ土酌{迫的響應和叢枝菌根的影響.pdf

1、磷(P)是植物生長發(fā)育最為重要的生命元素之一，廣泛參與植物體內(nèi)的生化合成、能量轉(zhuǎn)移、信號轉(zhuǎn)導等代謝過程。由于化學和微生物的強烈固定，大多數(shù)自然土壤中的有效磷很低，限制著植物的生長發(fā)育。植物為了適應低磷脅迫已經(jīng)進化出了包括改變根系形態(tài)結(jié)構(gòu)、與土壤中的菌根(Mycorrhiza)真菌形成共生體系、誘導高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白(PT)的表達、改善根際土壤化學性質(zhì)等形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化上的響應機制。然而，植物能夠吸收磷素最重要的是實現(xiàn)根系細胞內(nèi)磷的跨膜運

2、輸。植物根系吸收磷需要從質(zhì)外體運輸?shù)焦操|(zhì)體，這是一個從低磷到高磷的跨膜運輸過程。運輸過程中磷與2-4個質(zhì)子通過共轉(zhuǎn)運的模式進入到細胞質(zhì)。細胞質(zhì)內(nèi)pH值的降低需要質(zhì)膜H+-ATPase將過多的H+泵到細胞外以保持細胞間的pH平衡。由此形成的電勢差為P素的吸收提供了驅(qū)動力。水稻作為一種模式作物，是我國最重要的糧食作物，因此開展水稻根系H+-ATPase基因功能研究及其與磷營養(yǎng)的響應機制研究，對揭示植物高效調(diào)控吸收和轉(zhuǎn)運磷營養(yǎng)的機理以及培育磷

3、素高效吸收利用水稻品種具有重要意義。
　　 本研究以模式品種日本晴(Oryza sativa cv.Nipponbare L.)，水稻質(zhì)膜質(zhì)子泵基因OsA8完全敲除的純合突變體osa8(Tos17插入突變)及其野生型植株(Oryze Sativa ssp。Japonica cv.Hitomebore)為材料，通過RT-PCR、轉(zhuǎn)基因等方法研究了水稻根系質(zhì)膜H+-ATPase對磷脅迫及菌根調(diào)控的響應機制和部分H+-ATPase基因

4、的功能。獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.通過測定不同供磷水平下水稻根系質(zhì)膜質(zhì)子泵的活性結(jié)果顯示，磷脅迫水稻根系質(zhì)子泵的泵活性高于本身的水解活性，Vmax增加，Km降低。說明是由于質(zhì)膜H+-ATPase編碼的基因在轉(zhuǎn)錄水平表達的增強，酶蛋白(翻譯水平)增強的綜合影響，亦或是翻譯后水平的調(diào)控。磷脅迫時水稻根系的質(zhì)膜H+-ATPase活性升高，可能對其根系分泌有機陰離子有一定的作用，以此來活化土壤中的難溶性磷，提高植物對磷的吸收。

5、r>　　 2.通過生物信息學分析和轉(zhuǎn)基因技術(shù)分析討論了水稻質(zhì)膜H+-ATPase家族中各個基因的特點：水稻H+-ATPase家族基因分布在五個亞家族中(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)，同家族基因同源性達到80％以上。通過構(gòu)建啟動子與GUS報告基因融合的表達載體，檢測了OsA2、OsA3、OsA4、OsA7和OsA8基因的時空表達特征.GUS染色發(fā)現(xiàn)，在正常生長條件下OsA2、OsA3、OsA4和OsA7在根尖、側(cè)根發(fā)生區(qū)、根莖結(jié)合部位以及葉片中

6、均有表達，而OsA8基因在這些部位中均不表達或表達很弱。RT-PCR的結(jié)果顯示，屬于質(zhì)膜H+-ATPase家族基因Ⅰ和Ⅱ兩個亞家族的OsA2、OsA3和OsA7基因在植株根系和地上部有較強烈的表達，與GUS染色結(jié)果相一致。而沒有表達或表達極低的OsA8基因可能在特定的部位，或特殊的條件或時間下表達。
　　 3.OsA8啟動子融合GUS報告基因的轉(zhuǎn)基因水稻侵染試驗結(jié)果顯示，OsA8基因在菌根水稻根系的叢枝部位不表達。
　　

7、 4.Osa8突變體及其野生型水稻低磷條件下接種菌根菌(G.intraradices)的砂培試驗結(jié)果表明，菌根誘導水稻質(zhì)子泵基因OsA8在根系中的增強表達高達105倍。而同家族的OsA1、OsA2、OsA3、OsA7和OsA9則在根系中出現(xiàn)了顯著的下調(diào)趨勢。與野生型水稻相比，OsA8基因的突變導致了水稻菌根真菌的侵染效率降低了約20％，并且水稻根系中磷濃度的升高、地上部磷濃度的降低。這可能是由于OsA8基因的缺失，降低了水稻中磷素從根系

8、向地上部的轉(zhuǎn)運，使得根系中磷素積累濃度相對較高。從而直接導致了水稻高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白Pht1家族基因中除OsPT8外的很多成員在根系中表達量的降低。
　　 5.OsA8基因超表達水稻對磷營養(yǎng)的響應試驗結(jié)果顯示，OsA8基因超表達提高了水稻質(zhì)膜H+-ATPase的活性。在低磷脅迫條件下，OsA8基因超表達顯著提高了水稻對磷的吸收速率以及植株體內(nèi)磷素從根系向地上部的轉(zhuǎn)運速率。這與osa8突變體中降低了磷素從根系向地上部的轉(zhuǎn)運結(jié)果相

9、一致。這種改變伴隨著水稻H+-ATPase基因和水稻高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白家族基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達的變化。超表達OsA8基因下調(diào)了OsA1、OsA3和OsA9基因在葉片中的表達量。對Pht1家族而言，除了與低磷誘導增強表達的關(guān)鍵基因OsPT2和OsPT6有著密切的關(guān)系以外，超表達OsA8基因同時也下調(diào)了同家族的OsPT1、OsPT3、OsPT4和OsPT9的表達。
　　 總之，通過對敲除質(zhì)膜質(zhì)子泵基因的突變體和超表達突變體的分析，

10、我們發(fā)現(xiàn)低磷脅迫時，質(zhì)膜質(zhì)子泵OsA8基因通過影響根系質(zhì)膜質(zhì)子泵的活性，改變了水稻對菌根菌的侵染和磷素的吸收能力，又因下調(diào)部分水稻高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達而影響了水稻植株體內(nèi)根系和地上部磷的分布情況，進而反饋調(diào)控了Pht1家族其他基因的表達特征。由此，OsA8基因在響應低磷脅迫和菌根菌侵染時表現(xiàn)出來的對磷素吸收和磷素從根系向地上部轉(zhuǎn)運速率的重要作用，有望應用于通過轉(zhuǎn)基因手段培育適應低磷條件生長和促進菌根形成的磷素高效利用的水稻新品