氨芐青霉素殘留免疫學(xué)快速檢測技術(shù)研究.pdf

1、本研究對氨芐青霉素(AMP)的免疫原性、人工抗原合成、多克隆抗體(pAb)和單克隆抗體(mAb)制備及其特性和試劑盒研制及其性能等進(jìn)行了研究。 在分析AMP分子結(jié)構(gòu)和免疫原性基礎(chǔ)上，利用AMP上的羧基和氨基，分別用碳化二亞胺化法(EDC)和戊二醛法(GA)將AMP偶聯(lián)于牛血清白蛋白(BSA)和雞卵清蛋白(OVA)，合成人工免疫原BSA-EDC-AMP、BSA-GA-AMP和包被抗原OVA-EDC-AMP、OVA-GA-AMP，通

2、過紫外(Uv)、SDS-PAGE和免疫小鼠后抗血清的ELISA鑒定，BSA-EDC-AMP和BSA-GA-AMP偶聯(lián)成功，分子結(jié)合比為8:1和15:1，獲得了高價、敏感、特異的抗血清。但經(jīng)過對兩種免疫原的阻斷ELISA檢測，BSA-EDC-AMP的抑制效果優(yōu)于BSA-GA-AMP，然后用BSA-EDC-AMP免疫新西蘭白兔，其間接ELISA效價為1:6.4×105，阻斷ELISA測定半數(shù)抑制濃度(IC50)為31.6μg/mL，與鄰氯青

3、霉素的交叉反應(yīng)率(CR％)為39.4％，與其它化合物的CR<0.5％，瓊脂雙擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明產(chǎn)生了針對AMP的特異性抗體。 用BSA-EDC-AMP免疫Balb/C小鼠，免疫后用間接ELISA和阻斷ELISA選擇出細(xì)胞融合備用小鼠，應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)篩選出1C8、2H6、3F9和3G7共4株敏感特異的雜交瘤細(xì)胞，用體內(nèi)誘生腹水法制備AMP mAb，經(jīng)鑒定，其間接ELISA效價細(xì)胞培養(yǎng)上清分別為1:6.4×102、1:3.2×102

4、、1:1.28×103、1:3.2×102，腹水分別為1:3.2×105、1:5.12×105、1:8.1×105、1:6.4×105，同種型分別為IgG2a/λ、IgG2a/κ、IgG1/κ、IgG1/λ，親和常數(shù)(Ka)分別為4.49×108、5.16×108、2.06×109和9.81×108L/mol，其中親和力最高的3F9株阻斷ELISA測定其IC50為5.2 ng/mL，與鄰氯青霉素的CR％為18.6％，與其他化合物的CR<

5、0.5％。 本實(shí)驗(yàn)制備的AMP pAb和AMP mAb均可用于AMP殘留檢測的免疫學(xué)試驗(yàn)，AMP mAb更好。應(yīng)用AMP mAb研制出AMP殘留快速檢測阻斷ELISA試劑盒的質(zhì)量性能更好，AMP-Kit的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈S型，符合4參數(shù)logit曲線擬合，靈敏度為1.7 ng/mL，線性檢測范圍為1.7～165.0 ng/mL；牛奶樣、豬尿樣和飼料樣的平均添加回收率分別為101.3％、102.4％和106.7％，平均批內(nèi)和批間變異系數(shù)