黃瓜耐冷相關(guān)基因CsLDC的克隆分析及外源生長(zhǎng)物質(zhì)調(diào)節(jié)耐冷性的生理機(jī)制研究.pdf

1、黃瓜（Cucumis sativus L.）是重要的設(shè)施蔬菜之一，也是典型的冷敏植物。在早春和秋冬季節(jié)，低溫是產(chǎn)量和質(zhì)量的限制因子，因此，黃瓜耐冷性的提高成為周年供應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過(guò)育種和栽培的綜合手段克服黃瓜生產(chǎn)中的低溫障礙是解決這個(gè)問(wèn)題的主要手段，也是設(shè)施黃瓜的研究熱點(diǎn)，而正確理解黃瓜的耐冷機(jī)制是耐冷育種和栽培的良好基礎(chǔ)。為探明黃瓜耐低溫脅迫的生理和分子生物學(xué)機(jī)制，本文以(8-15°C)亞適宜低溫為脅迫因子，應(yīng)用植物生理學(xué)、生物

2、化學(xué)、分子生物學(xué)及功能基因分析的手段，研究低溫影響黃瓜生長(zhǎng)的機(jī)理，探明參與抗逆調(diào)控的重要植物生長(zhǎng)類物質(zhì)多胺(PAs)和水楊酸(SA)調(diào)節(jié)黃瓜耐冷性的生理生化作用機(jī)制，克隆分析了黃瓜耐冷相關(guān)基因CsLDC。
　　 取得了以下主要研究結(jié)果：
　　 1.黃瓜賴氨酸脫羧酶(CsLDC)的全長(zhǎng)cDNA序列克隆和冷脅迫過(guò)程中CsLDC基因表達(dá)的初步研究
　　 高質(zhì)量的RNA是研究基因表達(dá)以及后續(xù)下游試驗(yàn)的關(guān)鍵，常規(guī)的Triz

3、ol法對(duì)于種子和果實(shí)這類器官來(lái)說(shuō)，很難提到理想的RNA.通過(guò)對(duì)幾種方法的比較研究，對(duì)尿素-氯化鋰法進(jìn)行了改良，結(jié)果表明：對(duì)種子這類多糖、多酚以及蛋白質(zhì)含量高的器官，改良尿素－氯化鋰法能夠獲取高質(zhì)量RNA，其28S、18S和5S電泳帶型清晰完整，A260/A280值在2.0-2.1之間，用其進(jìn)行其反轉(zhuǎn)錄的cDNA，不僅可以用作RT-PCR、也可以用做AFLP、RACE（快速擴(kuò)增cDNA末端）以及Real time-PCR等后續(xù)研究.此外，

4、該方法同樣可以用于葫蘆科其它作物如絲瓜、南瓜及甜瓜的種子，以及葉片RNA的提取。
　　 根據(jù)本課題組已報(bào)道的長(zhǎng)度為132bp黃瓜耐冷相關(guān)基因（ccrt132）片段序列（逯明輝，2005），運(yùn)用RACE技術(shù)技術(shù)，克隆了長(zhǎng)度為1069bp的全長(zhǎng)cDNA序列。該序列的有效開放閱讀框共含648個(gè)核苷酸編碼一個(gè)長(zhǎng)為215個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。經(jīng)比對(duì)該全長(zhǎng)cDNA及其編碼的蛋白質(zhì)序列，與幾個(gè)植物的賴氨酸脫羧酶基因有較高的同源性，因此對(duì)該基因

5、命名為黃瓜賴氨酸脫羧酶（Cucumis sativus Lysine Decarboxylase, CsLDC）。CsLDC含有高度保守的賴氨酸脫羧酶結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)高度保守的基序PGGXGTXXE，經(jīng)預(yù)測(cè)，CsLDC蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)和已經(jīng)報(bào)道的擬南芥賴氨酸脫羧酶晶體結(jié)構(gòu)高度相似，與擬南芥賴氨酸脫羧酶進(jìn)化關(guān)系較近。用RT-PCR和熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究?jī)蓚€(gè)耐冷性不同的黃瓜品種在冷脅迫過(guò)程中基因表達(dá)的結(jié)果表明，低溫脅迫下，耐冷品種長(zhǎng)春密刺

6、的種子及幼葉中CsLDC基因均能被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，但在冷敏品種北京截頭中表達(dá)量較低，提示該基因與黃瓜的耐冷性有關(guān)。
　　 2.外源多胺(PAs)調(diào)節(jié)抗氧化酶增強(qiáng)黃瓜耐冷性的研究
　　 低溫處理后1d，耐冷品種長(zhǎng)春密刺葉片中Put、Spd、Spm被誘導(dǎo)生成，Put含量達(dá)到最大，隨后呈下降趨勢(shì)，但Spd和Spm含量卻持續(xù)上升，其中Spd含量始終高于Put和Spm含量。北京截頭葉片中，Put含量在低溫處理后1d增加，隨后緩慢下降

7、，而Spd含量一直呈下降趨勢(shì)，Spm含量變化不大。外源Put和Spd處理均能提高兩個(gè)品種內(nèi)源三種多胺含量，但是長(zhǎng)春密刺葉片中內(nèi)源Put、Spd、Spm整體高于北京截頭，外源Spd對(duì)提高內(nèi)源多胺含量的影響大于外源Put，多胺抑制劑丙酮雙脒腙(MGBG)卻能抑制兩個(gè)品種葉片中Spd、Spm的產(chǎn)生，但是對(duì)冷敏品種的影響大于對(duì)耐冷品種的影響。低溫降低了兩個(gè)品種可溶性蛋白的含量、抗氧化酶SOD、POD、CAT和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性，并

8、影響細(xì)胞膜穩(wěn)定性，但是對(duì)北京截頭的影響大于長(zhǎng)春密刺，這種影響可以通過(guò)外源Put和Spd而得到緩解，如減少了兩個(gè)品種葉片由于冷害引起的電解質(zhì)滲透和丙二醛含量，但是不同多胺種類所起作用因品種而異，多胺抑制劑MGBG預(yù)處理后可以抵消多胺(PAs)的作用。此外，組織化學(xué)染色和定量測(cè)定表明，應(yīng)用外源Put和Spd可以消除或減少由低溫脅迫引起的過(guò)氧化氫(H2O2)積累，而MGBG的作用剛好相反，這種情況在北京截頭中尤為明顯.值得注意的是，在低溫脅迫

9、下長(zhǎng)春密刺葉片三種內(nèi)源多胺含量均高于北京截頭，低溫處理前長(zhǎng)春密刺和北京截頭幼苗中SOD、POD和CAT活性沒(méi)有明顯差異，但低溫處理整個(gè)過(guò)程前者APX始終高于后者.這些結(jié)果表明多胺(PAs)在黃瓜耐低溫脅迫方面具有重要作用，而這種作用很有可能通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn).
　　 3.水楊酸對(duì)低溫脅迫黃瓜抗氧化系統(tǒng)和耐冷性的影響
　　 低溫脅迫下兩個(gè)品種葉片中內(nèi)源SA含量明顯高于種子，耐冷品種長(zhǎng)春密刺的萌動(dòng)種子和幼苗葉片內(nèi)源SA

10、含量均高于冷敏品種北京截頭；長(zhǎng)春密刺葉片中Pro和POD代謝水平高于冷敏品種北京截頭，而MDA、電解質(zhì)滲漏率和H2O2積累則低于北京截頭，外源SA處理能顯著提高低溫脅迫條件下黃瓜葉片的POD活性及可溶性蛋白含量，降低MDA含量和電解質(zhì)滲出率；相比北京截頭來(lái)說(shuō)，水楊酸對(duì)低溫脅迫下長(zhǎng)春密刺葉片中的H2O2積累具有更為明顯的消除作用。結(jié)果提示品種間耐冷性不同導(dǎo)致了內(nèi)源水楊酸代謝水平的差異，外源水楊酸可以提高黃瓜抵抗低溫脅迫的能力，而且這種作用